尚立芝　張紫娟　謝文英　張良芝　常學輝胡文豪　(河南中醫(yī)學院，河南　鄭州　450008)

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愛羅咳喘寧對慢性阻塞性肺疾病大鼠腫瘤壞死因子-α、巨噬細胞炎性蛋白-2、髓過氧化物酶、炎細胞及肺組織病理變化的影響

尚立芝張紫娟謝文英張良芝常學輝1胡文豪(河南中醫(yī)學院，河南鄭州450008)

〔摘要〕目的觀察愛羅咳喘寧口服液對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺勻漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-2、和髓過氧化物酶(MPO)變化及肺組織結構的影響，探討愛羅咳喘寧方對COPD作用的可能機制。方法采用脂多糖(LPS)加煙霧誘導COPD大鼠模型，大鼠被隨機被分為正常組、模型組、愛羅咳喘寧口服液低、中、高劑量組。正常組、模型組灌胃蒸餾水(10 g·kg－1·d－1)，愛羅咳喘寧口服液低、中、高劑量組分別灌胃混懸液5，10，20 g·kg－1·d－1，連續(xù)7 d。酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定各組大鼠BALF和肺組織勻漿中TNF-α和MIP-2的含量，比色法測定MPO活性。結果與正常組比較，模型組BALF和肺組織勻漿TNF-α、MIP-2和MPO均顯著升高(P均＜0. 05);與模型組相比，愛羅咳喘寧口服液中劑量組TNF-α、MIP-2和MPO均顯著降低(P均＜0. 05)。結論愛羅咳喘寧口服液治療COPD的作用機制可能與抑制TNF-α、MIP-2和MPO的釋放有關。

〔關鍵詞〕慢性阻塞性肺疾病;腫瘤壞死因子-α;巨噬細胞炎性蛋白-2;髓過氧化物酶

1河南省中醫(yī)院

第一作者:尚立芝(1960-)，女，副教授，碩士生導師，主要從事中藥方劑基礎與臨床研究。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以慢性非特異性氣道炎癥為主要病變特征的慢性支氣管炎和(或)肺氣腫，發(fā)病率和病死率隨著年齡的增長而增加〔1〕。COPD的發(fā)病機制目前未完全清楚，由多種炎癥細胞及炎癥介質參與且相互作用所致，中性粒細胞在氣道腔內大量聚集、活化、釋放蛋白酶等多種酶類及氧自由基等，導致支氣管肺組織損傷。COPD主要臨床表現(xiàn)咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀，屬中醫(yī)“咳嗽”?、“痰飲”、“喘證”等范疇。中醫(yī)認為本病其標在肺，其本在脾、腎。本課題組根據方證相關自擬愛羅咳喘寧方，兼顧宣肺化痰、止咳平喘、健脾固腎。經多年臨床和前期動物實驗研究結果均顯示，愛羅咳喘寧口服液能顯著提高COPD患者和動物模型的肺功能、改善肺組織結構，但其作用機制不明〔2～7〕。本研究觀察愛羅咳喘寧對COPD大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織勻漿中參與炎癥反應的腫瘤壞死因子(TNF)-α、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-2、髓過氧化物酶(MPO)及病理變化的影響。

1　材料與方法

1. 1藥物愛羅咳喘寧方藥物組成:炙麻黃6 g，苦杏仁10 g，茯苓15 g，赤芍10 g，半夏10 g，葶藶子10 g，蒼術10 g，干姜6 g，麥芽20 g，白術12 g，山藥15 g，黨參15 g，芫花6 g等，以上藥物經河南中醫(yī)學院董誠明教授鑒定，由河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院制劑室制成口服液，真空包裝，每支100 ml，含生藥100 g。

1. 2試劑與儀器測定BALF和肺組織勻漿中TNF-α和MIP-2含量ELISA試劑盒、MPO活性試劑盒均購于南京建成生物工程有限公司。自制動物熏吸箱(50 cm×50 cm×40 cm)，18號靜脈套管針，脂多糖(LPS，solarbio公司，L8880，701c034)，紅旗渠牌香煙(烤煙型，焦油含量14 mg/支，尼古丁含量1. 1 mg/支，河南安陽卷煙廠)。電熱恒溫培養(yǎng)箱(金壇市白塔新寶儀器廠，DHP-260)，318C酶標儀(上海精密科學儀器有限公司)，TGL-16GA低溫高速離心機(上海安亭儀器廠)，VIS-7220型分光光度儀(北京第二光學儀器廠)，F(xiàn)AME16/30F全自動酶標議(瑞士哈美頓公司)。U-CMAD3型顯微鏡(日本OLYMPUS)，顯微攝像儀OLYMPUS TOKYO(JAPAN 20486)等。

1. 3動物6月齡雄性SD大鼠50只，清潔級，體質量(300± 20)g。由河南省實驗動物中心提供(HNLA-2010-111)。隨機分為五組:正常組、模型組、愛羅咳喘寧口服液低、中、高劑量組(5，10，20 ml·kg－1·d－1)組，每組10只。

1. 4模型制備參照文獻〔7，8〕制備LPS加煙霧誘導COPD大鼠模型。采用氣管注脂多糖加熏香煙方法:在第1，14天，用1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)ip麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1 ml注射器注入溶于生理鹽水的LPS200 μl(1 mg/ml)，然后將大鼠固定板直立旋轉，使LPS能夠均勻分布于兩肺。第2～28天(第14天除外)將大鼠置入熏箱內，內熏香煙煙霧，40 min/次，2次/d(每次8支煙)，每周休息1 d;正常組，第1天、第14天經氣管注入200 μl生理鹽水，其余無特殊處理。

1. 5給藥方案參考文獻〔9〕，正常組、模型組灌胃給予蒸餾水(10 g·kg－1·d－1)，各治療組大鼠給予愛羅咳喘寧口服液低、中、高劑量組分別灌胃混懸液(5，10，20 g·kg－1·d－1)，連續(xù)7 d。

1. 6 BALF的制備及TNF-α、MIP-2、MPO檢測斷頭處死大鼠，開胸暴露氣管和肺門，結扎右主支氣管。用套管針穿刺至左肺，以生理鹽水2ml×3次行肺泡灌洗，回收率約80%，BALF存入可防止細胞附壁的硅塑管內靜置1 h。取1 ml BALF以2 000 r/min離心5 min后，取上清液置入EP管保存于－20℃冰箱中待檢。檢測BALF上清液中TNF-α、MIP-2及MPO濃度測定，均按照試劑盒說明書操作。

1. 7肺組織勻漿TNF-α、MIP-2濃度及MPO活性測定〔10〕取各組大鼠右肺組織1. 0 g，在預冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙拭干，用冷鹽水制備成10%的肺勻漿，將10%勻漿于4℃離心2 000 r/min離心10 min收集上清液，－20℃凍存待測。用ELISA測定上清液TNF-α、MIP-2濃度。按照試劑盒說明書操作在酶標儀450 nm波長處，以空白對照孔調零，直接測定吸光度(A)值，并由標準曲線公式換算成各蛋白的濃度值。根據南京建成生物工程研究所提供的MPO測定試劑盒說明書，進行分光光度計比色測定MPO活性。

1. 8 HE染色標本制備取右下肺組織，10%甲醛固定，常規(guī)包埋切片，HE染色。

1. 9統(tǒng)計學處理采用SPSS11. 5統(tǒng)計軟件包行方差分析。

2　結果

2. 1大鼠一般情況實驗結束時，正常組，一般狀況好，體重增長，無死亡。模型組，體重較造模前下降或略有增加，死亡2只。愛羅咳喘寧高、中、低劑量組大鼠體重增加，高、低劑量組各死亡1只。

2. 2 BALF和肺勻漿中TNF-α、MPO和MIP-2變化模型組BALF中TNF-α、MIP-2和MPO都顯著高于正常組(P均＜0. 05);愛羅咳喘寧低、中、高劑量組TNF-α、MIP-2和MPO都顯著低于模型組(P均＜0. 05，表1)。與正常組比較，模型組肺勻漿中TNF-α、MIP-2和MPO均顯著升高(P均＜0. 05);與模型組相比，愛羅咳喘寧低、中、高劑量組TNF-α、MIP-2和MPO均顯著降低(P均＜0. 05)。見表2。

表1　愛羅咳喘寧對各組大鼠BALF中TNF-α、MIP-2和MPO的影響(x±s)

表2　愛羅咳喘寧對各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、MIP-2和MPO的影響(x±s)

2. 3病理學改變

2. 3. 1大體形態(tài)觀察正常組肺臟顏色略呈粉紅色，表面光滑無斑點。模型組肺臟較大，暗紅，邊緣鈍圓，多數肺臟表面有局部隆起現(xiàn)象;各治療組肺臟增大，色澤深紅，小部分肺臟邊緣鈍圓，表面不光滑呈點狀隆起，但沒有模型組明顯。

2. 3. 2組織切片(HE染色)光鏡下顯示，正常組氣管、支氣管黏膜，上皮細胞排列整齊，無變性、壞死及脫落，管壁各層均無炎細胞浸潤和增生，氣道管腔內無滲出物;肺泡結構正常。模型組細支氣管管腔內有滲出物，細支氣管管壁上皮多處變性、壞死而脫落，管壁各層炎細胞明顯浸潤;部分血管周圍水腫，局部細支氣管管壁因血管充血、間質水腫而增厚，腔內有分泌物，細支氣管周圍肺泡擴張、融合，部分肺大泡，其附近局限性肺不張。高劑量組多數細支氣管壁周圍淋巴細胞聚集成為淋巴濾泡。與模型組比較，愛羅咳喘寧中劑量組肺組織病理改變較模型組輕，細支氣管黏膜損害較淺，上皮趨于完整，細支氣管腔內少量滲出物;肺泡內出現(xiàn)少量巨噬細胞和紅細胞、部分肺泡擴張。肺組織充血減少，除血管壁外周有輕度水腫外，肺組織基本正常。愛羅咳喘寧低劑量組與模型組接近，療效較差。見圖1。

圖1　愛羅咳喘寧對肺組織結構的影響(HE，×100)

3　討論

COPD臨床表現(xiàn)屬中醫(yī)“咳嗽”、“痰飲”、“喘證”等范疇。中醫(yī)認為“虛”、“痰”、“瘀”、“氣滯”，累及肺、脾、腎三臟，故解決患者的“咳”、“痰”、“喘”等癥，其關鍵在于:宣肺降肺;益氣行氣;化痰祛瘀;健脾益腎?；诜阶C相關理論，創(chuàng)立了愛羅咳喘寧方，方中炙麻黃主治肺氣壅遏，杏仁祛痰平喘，半夏燥濕化痰，葶藶子祛痰平喘;干姜溫肺化飲;茯苓健脾化痰;芫花祛痰止咳。黨參健脾益肺，白術健脾益氣，山藥固腎益精;蒼術燥濕健脾，麥芽健脾和胃，赤芍活血祛瘀〔5〕。

研究表明，COPD氣道與肺實質的持續(xù)炎癥病變涉及炎癥細胞釋放的各種炎癥介質。在COPD炎癥中TNF-α升高〔11，12〕，是COPD病情加重的一個重要指標，也是COPD嚴重程度的重要標志〔13〕。

MPO是中性粒細胞嗜天青顆粒產生的一種重要的過氧化物酶，主要存在于中性粒細胞中。MPO可通過脂質過氧化作用引起肺組織損傷。MPO活力變化代表著中性粒細胞功能和活性狀態(tài)，MPO可作為中性粒細胞的活化標志物〔14〕。MPO反映中性粒細胞的浸潤情況，又可定量反映炎性損傷的程度。本實驗用LPS加煙霧制備COPD大鼠模型結果與彭紅星等〔15〕報道結果相一致，說明在COPD大鼠氣道確實存中性粒細胞的聚集，活化，提示模型組氣道內中性粒細胞脫顆粒釋放過量的MPO等酶類和細胞因子，誘導了氣道炎癥和組織損傷。

MIP-2是肺泡巨噬細胞和氣道上皮細胞分泌的蛋白質產物，氣道內中性粒細胞的聚集和活化與一些特異性的趨化因子活性作用密切相關〔16〕。MIP-2是一種趨化因子，其特異靶細胞為中性粒細胞，對其起重要的趨化和激活作用。本實驗結果與茅培英等〔17〕報告結果相一致，提示在COPD模型中MIP-2可能通過對中性粒細胞的化學趨化作用和活化作用參與了炎細胞在氣道及肺組織內的聚集，導致中性粒細胞脫顆粒釋放過量MPO、蛋白酶、彈性酶等溶解細胞外基質進而炎細胞浸潤，誘發(fā)炎癥反應和肺組織損傷〔18，19〕，這可能是COPD炎癥形成的可能機制之一。

COPD的病理基礎是慢性氣道炎癥，以氣道中的中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤為主。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組BALF和肺組織勻漿中TNF-α、MPO和MIP-2均顯著增高，與文獻報道〔20〕相近，提示TNF-α、MPO和MIP-2共同參與COPD炎癥反應。本研究顯示愛羅咳喘寧可減低BALF和肺組織勻漿中TNF-α、MPO和MIP-2水平，從而發(fā)揮其抗炎作用，肺組織病理形態(tài)也予以證實。這可能是愛羅咳喘寧治療COPD的作用機制之一。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者:謝文英(1963-)，女，碩士，教授，碩士生導師，主要從事內科雜病的防治研究。

基金項目:河南省高等學校重點科研項目(15A360030);河南省中醫(yī)藥科學研究專項課題(2013ZY02070);鄭州市科技領軍人才項目(121PLJRC535)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5705-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 011

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R285. 5