楊　銳　賈　強　劉小粉　王元元　李正紅　關宿東　馬善峰　(蚌埠醫(yī)學院，安徽　蚌埠　233030)

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硫化氫對糖尿病大鼠心肌鈣調蛋白活性和基因表達的影響

楊銳賈強劉小粉王元元李正紅關宿東馬善峰(蚌埠醫(yī)學院，安徽蚌埠233030)

〔摘要〕目的觀察硫化氫(H2S)對糖尿病大鼠心肌肌漿網鈣泵(SERCA)活性及鈣調控蛋白基因表達的影響。方法雄性SD大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、糖尿病對照組(DM組)、NaHS治療組(NaHS+DM組)和NaHS對照組(NaHS組)。采用鏈脲佐菌素(STZ)55 mg/kg腹腔注射誘導糖尿病大鼠模型。測定大鼠的心系數; HE染色觀察心肌組織的病理學變化;利用無機磷比色法測定大鼠心肌SERCA活性; RT-PCR檢測心肌組織SERCA、受磷蛋白(PLB)、蘭尼堿受體2型(RyR2)和1，4，5-三磷酸肌醇受體2型(IP3R2)的基因表達。結果與NC組相比，NaHS組各項指標均無顯著差異(P＞0. 05);而DM組心系數明顯增大(P＜0. 01);心肌纖維排列紊亂，細胞腫脹明顯，有炎細胞浸潤;心肌SERCA的活性明顯降低(P＜0. 01); SERCA、RyR2和IP3R2mRNA表達降低(P＜0. 01)，PLB mRNA表達增加(P＜0. 01)。與DM組相比，NaHS+DM組心系數明顯降低(P＜0. 01)，心肌病理學變化明顯改善，SERCA活性明顯增加(P＜0. 01)，SERCA、RyR2和IP3R2mRNA表達明顯增加(P＜0. 01)，PLB mRNA表達降低(P＜0. 01)。結論H2S對糖尿病大鼠心肌損傷具有保護作用，其機制可能與調節(jié)鈣調控蛋白的基因表達，增強鈣泵活性有關。

〔關鍵詞〕硫化氫;糖尿病;心肌;肌漿網鈣泵;鈣調控蛋白

糖尿病心肌病是糖尿病(DM)并發(fā)的心血管疾病，其病理改變主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大、變性、灶性壞死，肌絲纖維大量丟失，心肌細胞外間質有不溶性膠原蛋白積聚、纖維化〔1〕。迄今為止，糖尿病心肌病的確切病因仍不清楚，目前認為其發(fā)生與自由基損傷、心肌細胞內異常的鈣離子代謝等有關。細胞內Ca2+濃度是心肌收縮和舒張的重要物質基礎，肌漿網對Ca2+的攝取和釋放是調控細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的關鍵環(huán)節(jié)〔2〕。正常心肌收縮和舒張依賴Ca2+調控蛋白的交互作用，主要包括肌漿網Ca2+-ATP酶(SERCA)、受磷蛋白(PLB)、蘭尼堿受體2型(RyR2)、1，4，5-三磷酸肌醇受體2型(IP3R2)〔3〕。硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3種新型氣體信號分子〔4〕，研究報道了H2S對心血管系統(tǒng)具有重要的生理作用〔5〕。但關于H2S對DM大鼠心肌的鈣調控蛋白方面的影響未見相關報道。本研究在復制DM大鼠模型的基礎上，觀察H2S對DM大鼠心肌肌漿網鈣泵的活性及鈣調控蛋白的基因表達，探討H2S對糖尿病心肌損傷的保護機制。

1　材料與方法

1. 1動物健康雄性SD大鼠，32只，清潔級，體重180～220 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1. 2主要藥品和試劑鏈脲佐菌素(STZ)和硫氫化鈉(NaHS)均購自Sigma公司; Ca2+-ATPase試劑盒和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所; RNAiso Plus試劑和RT-PCR逆轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司; PCR試劑盒購自Fermentas公司; SERCA、PLB、RyR2、IP3R2和β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所用SERCA引物:上游5'-AAG CAG TTC ATC CGC TAC CT-3'，下游5'-AGA CCA TCC GTC ACC AGA TT-3'，擴增產物長度為134 bp; PLB引物:上游5'-TAC CTT ACT CGC TCG GCT ATC-3'，下游5'-CAG AAG CAT CAC AAT GAT GCA G-3'，擴增產物長度為141 bp; RyR2引物:上游5'-ACT GCT AAA GTG ACC AAC AG-3'，下游5'-TTG CAT CGC TGA AAT CTA GT-3'，擴增產物長度為430 bp; IP3R2引物:上游5'-GCA GTT GAC TGA GGC GTC TT-3'，下游5'-GGA TTC GTG AGT GGC GAT AC-3'，擴增產物長度為421 bp;β-actin引物:上游5'-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA GGA C-3'，下游5'-GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA CT-3'，擴增產物長度為630 bp。

1. 3動物模型制備及分組雄性SD大鼠32只，適應性飼養(yǎng)1 w后隨機分為正常組16只，DM組16只。DM組大鼠空腹12 h后，一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，72 h后測空腹血糖值，取血糖值≥16. 7 mmol/L為DM模型，并隨機分為DM對照組(DM組)和NaHS治療組(NaHS+DM組)，每組8只。將正常大鼠隨機分為:正常對照組(NC組)，NaHS對照組(NaHS組)，每組8只。從造模成功后第4周起，NaHS組和NaHS+DM組開始腹腔注射NaHS溶液14 μmol·kg－1·d－1〔6〕(NaHS作為外源性H2S供體)，持續(xù)注射5 w。

1. 4心系數的測定大鼠實驗前禁食12 h，自由飲水，稱取大鼠體重(g)。大鼠置于斷頭器上斷頭，取出心臟，放入生理鹽水中洗凈血液，用濾紙吸干后，稱取心臟重量(mg)，以心重/體重比為心系數。

1. 5心肌細胞蘇木素-伊紅(HE)染色取心肌組織，置于10%中性甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色后，光學顯微鏡下觀察。

1. 6 SERCA活性的測定稱取50 mg心肌組織，制備心肌肌漿網〔7〕。用無機磷比色法測定。

1. 7 RT-PCR檢測SERCA、PLB、RyR2和IP3R2mRNA表達采用RNAiso Plus試劑提取左心室心肌組織總RNA。以總RNA為模板，根據反轉錄試劑盒要求反轉錄合成cDNA。以此cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增條件: 95℃預變性3 min后，以①95℃變性50 s，②SERCA退火溫度52. 4℃45 s，PLB退火溫度54. 5℃45 s，RyR2退火溫度50. 3℃45 s，IP3R2退火溫度54. 5℃45 s，β-actin退火溫度59. 4℃45 s;③72℃1 min，反應30個循環(huán)，最后一輪72℃延伸10 min。取5 μl PCR擴增產物，在含有溴乙啶的1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳。在GIS凝膠處理系統(tǒng)中拍攝記錄，用電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)分析計算各目的基因與β-actin條帶光密度比值(SERCA/β-actin; PLB/β-actin; RyR2/β-actin; IP3R2/β-actin)表示mRNA相對表達量。

1. 8統(tǒng)計學處理采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件，數據以x ±s表示。多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2　結果

2. 1 HE染色觀察心肌組織病理學變化NC組大鼠心肌纖維排列整齊，未發(fā)現(xiàn)變性、壞死等病理改變，心肌細胞核清晰，著色正常，心肌間隙正常; DM組心肌纖維排列紊亂，心肌細胞腫脹明顯，心肌間隙增寬，有炎細胞浸潤，胞質分布不均勻; NaHS+DM組心肌損害明顯改善，可見大部分心肌細胞排列整齊，結構完整，僅部分細胞有水腫，少數有心肌溶解、斷裂或間隙加寬，炎細胞浸潤減少; NaHS組心肌組織無異常改變。見圖1。

圖1　四組大鼠心肌組織病理學變化(HE，×400)

2. 2各組大鼠心系數的變化NC組和NaHS組大鼠體重和心臟重量無顯著差異(P＞0. 05);與NC組比較，DM組大鼠體重和心臟重量均降低(P＜0. 01)，心系數增大(P＜0. 01);與DM組比較，NaHS+DM組大鼠體重和心臟重量均增加(P＜0. 05)，心系數降低(P＜0. 01)。見表1。

表1　各組大鼠體重、心臟重量和心系數的變化(x±s，n=8)

與NC組比較: 1)P＜0. 01;與DM組比較: 2)P＜0. 05，3)P＜0. 01

2. 3心肌組織SERCA活性與NC組比較(4. 34±0. 56)，NaHS組SERCA活性無顯著差異(4. 21±0. 43，P＞0. 05);而DM 組SERCA活性明顯下降(2. 67±0. 45，P＜0. 01)。與DM組比較，NaHS+DM組SERCA活性明顯升高(3. 39±0. 37，P＜0. 01)，見表2。

2. 4心肌組織SERCA、PLB、RyR2和IP3R2mRNA的表達與NC組比較，NaHS組各項指標無顯著差異(P＞0. 05);而DM組SERCA、RyR2和IP3R2mRNA表達降低(P＜0. 01)，PLB mRNA表達增加(P＜0. 01)。與DM組比較，NaHS+DM組SERCA、RyR2和IP3R2mRNA表達增加(P＜0. 01)，PLB mRNA表達下降(P＜0. 01)。見表2，圖2。

表2　 SERCA、PLB、RyR2和IP3R2mRNA在大鼠心肌組織中的表達(x±s，n=8)

圖2　 SERCA、PLB、RyR2和IP3R2mRNA凝膠電泳圖

3　討論

糖尿病心肌病是由DM引起的心臟微血管病變、心肌代謝紊亂及纖維化等所導致的心肌結構異常，最終引起左心室肥厚、舒張期和(或)收縮期功能障礙的一種疾病。本研究結果顯示DM大鼠的心臟已發(fā)生肥厚性改變，補充外源性H2S可以減輕DM大鼠的心肌損傷。

H2S被認為是調節(jié)心血管功能的內源性氣體信號分子〔8〕。內源性H2S是由半胱氨酸磷酸吡多醛-5'-磷酸依賴性酶包括胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)及半胱氨酸轉移酶等催化作用下產生，其中CSE主要表達于血管組織和心肌中〔9〕。蘇鈺雯等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，內源性H2S對阿霉素心肌病大鼠的心肌組織具有保護作用，心肌組織中適宜的H2S水平對維持心肌組織正常結構與功能具有重要調節(jié)作用。Ca2+是心肌興奮-收縮耦聯(lián)的重要因子。當心肌細胞興奮時，細胞膜上L型Ca2+通道開放，Ca2+順濃度差從胞外進入胞內，并且觸發(fā)心肌細胞內的肌漿網(SR)鈣釋放通道打開，大量的Ca2+從SR進入胞內，引起胞內的Ca2+濃度的顯著增高，這一過程為鈣觸發(fā)鈣釋放，最終引起心肌的收縮。而心肌的舒張主要與SERCA有關，SERCA負責肌漿網對Ca2+的攝取，PLB是SERCA活性的抑制蛋白，而RyR2、IP3R2是肌漿網上Ca2+的釋放通道〔3〕。通過攝取和釋放Ca2+，SR在心肌收縮和舒張過程中發(fā)揮重要作用。當SR的鈣調蛋白功能發(fā)生異常時，會引起Ca2+代謝紊亂，容易導致心肌舒縮功能不全。高血糖會引起心肌細胞內鈣超載致心肌收縮功能減弱〔11〕。研究表明，DM大鼠心肌SERCA基因及蛋白水平下降〔12〕，PLB基因及蛋白水平增加〔13〕，RyR2、IP3R2基因表達減少〔14〕。本實驗結果證實，DM會引起心肌細胞發(fā)生鈣調控異常，最終導致心肌舒縮功能不全。本外源性補充H2S可以減輕心肌細胞鈣超載，改善DM大鼠的心肌舒縮功能，從而減輕DM對大鼠心肌的損傷。

4參考文獻

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〔2014-07-04修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

Effect of hydrogen sulfide on activity and gene expressions of calcium regulatory proteins in diabetic rats

YANG Rui，JIA Qiang，LIU Xiao-Fen，et al．
Bengbu Medical College，Bengbu 233030，Anhui，China

【Abstract】Objective To investigate the effect of hydrogen sulfide(H2S)on sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase(SERCA)activity and gene expressions of calcium regulatory proteins in diabetic rats．Methods Thirty-two male SD rats were divided into four groups randomly: normal control(NC)，diabetic(DM)，NaHS + diabetic(NaHS+DM)and NaHS groups(NaHS)．Diabetic rat was induced by injection of streptozotocin at 55 mg/kg intraperitoneally．After 8 weeks，heart weight/body weight were determined．The pathological changes of myocardial tissue were observed by HE staining，and the activity of SERCA was analyzed by colorimetric method of inorganic phosphorus．The expressions of SERCA，PLB(phospholamban)，RyR2(ryanodine receptor type 2)and IP3R2(1，4，5-trisphosphate inositor type 2)at mRNA level in myocardium were detected using RT-PCR．Results There were no significant differences in all indexes between NC and NaHS groups(P＞0．05)．However，compared with NC group，in diabetic rats，heart weight/body weight were increased(P＜0．01)．Cardiac muscle fibers were disorder，and myocytes were edema and hypertrophy，with inflammatory cell infiltration enhanced．The activity of SERCA was decreased(P＜0．01)．The mRNA levels of SERCA，RyR2and IP3R2 were decreased(P＜0．01)，PLB mRNA was increased(P＜0．01)in DM group．Compared with DM group，heart weight/body weight was decreased(P＜0．01)and the injury of myocardiac myofibrillae was attentuated in NaHS+DM group．SERCA activity was increased(P＜0．01)．The mRNA levels of SERCA，RyR2and IP3R2 were increased(P＜0. 01)，PLB mRNA was decreased(P＜0．01)．Conclusions H2S can protect myocardium in diabetic rats，it is related to regulating the gene expressions of calcium regulatory proteins and enhancing the activity of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase．

【Key words】Hydrogen sulfide; Diabetes mellitus; Myocardium; Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase; Calcium regulatory proteins

通訊作者:馬善峰(1971-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事心血管生理學研究。

基金項目:安徽省教育廳自然科學研究項目(No．KJ2015A163; KJ2013B146; KJ2015B006by);蚌埠醫(yī)學院科研項目(No．BY0907; BYKY1312; BYKY1414ZD)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5697-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 008

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R363. 2

第一作者:楊銳(1982-)，女，碩士，講師，主要從事心血管生理學研究。