王述菊　馬　駿　王彥春　曾曉玲　龔元勛　梁　艷　孫國杰(湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院，湖北　武漢　430065)

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電針對魚藤酮誘導的帕金森病模型大鼠黑質(zhì)內(nèi)ERK1/2及TNF-α的影響

王述菊馬駿王彥春曾曉玲龔元勛梁艷孫國杰
(湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院，湖北武漢430065)

〔摘要〕目的探討電針對帕金森病(PD)模型大鼠黑質(zhì)內(nèi)ERK1/2信號通路及炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的作用及機制。方法雄性健康SD大鼠32只，隨機分為正常組、假手術組、模型組、電針組，每組8只。模型組和電針組經(jīng)頸背部注射魚藤酮造模14 d，造模后進行行為學評價，電針組給予電針“風府”和“太沖”兩穴治療，連續(xù)治療14 d;其余各組不做治療，假手術組給予相同劑量的DMSO和生理鹽水混合液。采用免疫組化法檢測大鼠黑質(zhì)區(qū)磷酸化的ERK1/2、酪氨酸羥化酶(TH)、TNF-α陽性細胞表達情況。結果各組大鼠神經(jīng)行為學表現(xiàn)存在差異，與正常組、假手術組相比，模型組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)減少(P＜0. 05)，磷酸化的ERK1/2、TNF-α陽性細胞數(shù)增加(P＜0. 05);與模型組相比，電針組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)增加(P＜0. 05)，磷酸化的ERK1/2、TNF-α陽性細胞數(shù)減少(P＜0. 05)。結論電針可以通過調(diào)節(jié)PD模型大鼠體內(nèi)MAPK/ERK1/2通路，降低p-ERK1/2在PD模型大鼠黑質(zhì)區(qū)的表達，進而減少TNF-α的表達，對PD病的發(fā)生發(fā)展起到一定的調(diào)節(jié)作用。

〔關鍵詞〕帕金森病;電針; MAPK/ERK1/2; TNF-α;酪氨酸羥化酶

1　材料與方法

1. 1實驗動物及分組健康雄性SD大白鼠32只，體重(180± 20)g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供〔(合格證: SCXK(鄂)2010-0009，No. 4209800307〕。所有動物均在通風良好條件下分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。將動物隨機分成正常組、假手術組、模型組及電針組，各8只。實驗對動物的處理方法符合2006年中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1. 2主要藥物試劑及器材魚藤酮(rotenone)(美國Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO)(國藥集團化學試劑有限公司)、p-ERK、TNF-α抗體(北京博奧森公司)，兔抗鼠TH單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，4%多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)，10%水合氯醛(按國產(chǎn)分析純水合氯醛1 g，無菌生理鹽水9 ml比例配制)，S-P超敏試劑盒(鼠/兔)(福州邁新生物技術開發(fā)有限公司)，山羊抗兔免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司)，所有試劑均以焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的雙蒸水配制。0. 30 mm×13 mm不銹鋼毫針(蘇州產(chǎn)華佗牌)，G6805-2型電針治療儀(上海醫(yī)療器械廠)。

1. 3造模方法大鼠適應環(huán)境1 w后隨機分組，開始造模，采取頸背部皮下注射魚藤酮法制備PD大鼠模型。用DMSO和生理鹽水溶解魚藤酮配制成0. 25 mg/ml溶液(魚藤酮∶DMSO∶生理鹽水= 1 g∶3. 5 L∶0. 5 L)。其中模型組和電針組按1 mg· kg－1·d－1注射魚藤酮〔3〕，假手術組經(jīng)相同方式給予相同體積的DMSO和生理鹽水混合液(DMSO∶生理鹽水= 3. 5 L∶0. 5 L)，1次/d，連續(xù)14 d，正常組不予注射。

參照Chen等〔4〕行為學評分標準，PD模型大鼠出現(xiàn)典型的毛色變黃變臟、弓背、拘捕減弱、震顫等表現(xiàn)視為造模成功。

1. 4針刺方法電針組:對造模成功后的大鼠給予電針治療，給大鼠穿上自制的鼠衣固定，取“風府”、“太沖”穴，用0. 30 mm×13 mm不銹鋼毫針針刺，進針約4 mm，接G6805-2型電針治療儀，正極接“風府”穴，負極接“太沖”穴(雙側“太沖”穴每天交替)，采用連續(xù)波，頻率為2 Hz，刺激強度以大鼠腿部輕微抽動為度(2～6 mA)，治療20 min，1次/d，7 d為1個療程，療程間休息1 d，共治療2個療程后根據(jù)預定時間分別取材。其他組每天在相同時間抓取固定，但不給予治療。四組動物同步喂養(yǎng)、取材。

1. 5樣本采集四組處理結束24 h后，大鼠用10%水合氯醛(0. 4 g/kg)麻醉，仰臥位固定，開胸，暴露心臟，用灌胃針經(jīng)左心室穿刺入升主動脈，剪開右心耳，先用0. 1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)左心室灌流沖洗，后用含4%多聚甲醛磷酸緩沖液常規(guī)灌洗固定，待大鼠全身僵硬后，迅速斷頭取腦，留取中腦部分置于4%多聚甲醛中固定48 h(4℃)。石蠟包埋切片。

1. 6 S-P免疫組化法檢測腦組織行冠狀面連續(xù)切片(厚度約4 μm)，常規(guī)脫蠟至水，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);檸檬酸抗原修復液煮沸對組織進行抗原修復;滴加50 μl過氧化酶阻斷溶劑后孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);同一組織相鄰切片分別加入一抗即兔抗鼠TH單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)(1∶200)、羊抗鼠p-ERK、TNF-α單克隆抗體(北京博奧森公司)(1∶100); 4℃過夜; PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);加入50 μl二抗室溫下孵育10 min，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);滴加50 μl鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色;蘇木素復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固;鏡下觀察。陰性對照一抗用PBS代替，其余步驟同以上操作。選定黑質(zhì)所在區(qū)域，使用IMS圖像分析系統(tǒng)軟件分析。每組觀察5張切片，每張切片在光鏡高倍鏡下隨機取4個4 mm2視野，計算陽性反應細胞數(shù)，各組每張切片的4個視野陽性細胞計數(shù)相加后取平均值。

返鄉(xiāng)創(chuàng)業(yè)農(nóng)民工是壯大非遺文化產(chǎn)業(yè)的重要主體。由于返鄉(xiāng)創(chuàng)業(yè)農(nóng)民工了解外面的市場需求，當家鄉(xiāng)的鄉(xiāng)村旅游、文化休閑、觀光農(nóng)業(yè)等產(chǎn)業(yè)發(fā)展起來時，具有歷史記憶、地域特點、民族風情的特色文化產(chǎn)品逐漸被人接受與熟識，因此返鄉(xiāng)創(chuàng)業(yè)農(nóng)民工能夠參與市場競爭，做大做強非物質(zhì)文化遺產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)項目，推動非物質(zhì)文化遺產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。同時農(nóng)民工返鄉(xiāng)創(chuàng)業(yè)集群多渠道引進資金、人力來實現(xiàn)中小非遺文化企業(yè)的培育，有利于壯大非遺文化產(chǎn)業(yè)發(fā)展隊伍，提升非遺文化產(chǎn)業(yè)的整體實力。

1. 7統(tǒng)計學方法應用SPSS16. 0軟件進行單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，繼而以SNK-q檢驗處理數(shù)據(jù)。P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2. 1大鼠行為學改變觀察魚藤酮注射5 d后即有大鼠表現(xiàn)出捕捉時反抗減弱的現(xiàn)象，逐漸出現(xiàn)主動活動減少、爬行活動緩慢、震顫、拱背狀姿勢、瞬目減少、對刺激逃避反應慢等類似PD癥候群特征;另外，魚藤酮注射大鼠由于自我清潔能力下降，其毛色逐漸發(fā)黃，變臟，有掉毛現(xiàn)象，與其余組有明顯區(qū)別。部分大鼠有輕微口腔出血等現(xiàn)象，另外有大鼠出現(xiàn)肌肉震顫、全身抖動、四肢發(fā)僵等類PD癥狀，隨著造模天數(shù)增加，上述表現(xiàn)更加明顯。假手術組和正常組大鼠皮毛光滑，活潑好動，飲食如常。經(jīng)電針治療后，電針組PD大鼠的異常行為明顯改善。

2. 2大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、p-ERK1/2、TNF-α陽性細胞數(shù)變化

模型組TH陽性細胞明顯少于其余三組，p-ERK1/2、TNF-α陽性細胞明顯多于其余三組，與模型組相比，電針組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞明顯增多，p-ERK1/2、TNF-α陽性細胞明顯減少(P＜0. 05)。見表1。

2. 3大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、p-ERK1/2、TNF-α形態(tài)學變化TH陽性細胞質(zhì)呈棕黃色，模型組TH陽性細胞較正常組明顯減少，突起較少，染色明顯減弱，電針組與模型組差異明顯。p-ERK1/2和TNF-α的表達主要在細胞質(zhì)，正常組大鼠黑質(zhì)陽性細胞數(shù)量較少，胞質(zhì)著色較淺，而模型組大鼠黑質(zhì)陽性細胞數(shù)量增多，并且胞質(zhì)染色明顯加深，電針組與模型組差異明顯。見圖1～圖3。

表1　各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、p-ERK1/2、TNF-α陽性細胞數(shù)(個/mm2，n=8，x±s)

圖1　各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)組織TH表達(×400)

圖2　各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)組織p-ERK1/2表達(×400)

圖3　各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)組織TNF-α表達(×200)

3　討論

現(xiàn)今PD的發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)觀點認為該病系由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致。在遺傳方面，Parkin、PARK5基因的過表達與抑制、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路網(wǎng)絡的異常激活都可引起DA神經(jīng)元活性發(fā)生改變。而環(huán)境因素引起的氧化應激、炎癥反應及線粒體功能障礙亦是引起DA神經(jīng)元死亡的主要原因〔5〕。在眾多PD的危險因素中，越來越多證據(jù)表明，以小膠質(zhì)細胞激活為主的腦內(nèi)炎癥與PD的病程發(fā)展相關〔6〕。Reale等〔7〕發(fā)現(xiàn)PD患者MCP-1、TNF-α、IFN-γ、IL-lβ等因子的表達水平顯著增高(P＜0. 01)。本課題組在前期的研究中亦發(fā)現(xiàn)〔8〕，電針能夠通過抑制黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞介導激活的炎癥反應，減少炎癥介質(zhì)如TNF-α，IL-1β，IFN-γ的表達，從而增加黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量，促進DA能神經(jīng)元恢復，阻止PD病理進程，對PD的癥狀起到一定的改善作用。

有文獻證實〔9〕，ERK1/2大量存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并參與神經(jīng)組織的各個生理和病理過程。在剖檢的PD患者中腦黑質(zhì)中有明顯的p-ERK顆粒聚集，而在正常對照老年組卻極少有磷酸化ERK1/2聚集〔10〕。近來有研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2的活化與PD密切相關，靜息狀態(tài)時ERK1/2位于細胞的胞質(zhì)內(nèi)，當被激活后，ERK1/2迅速進行磷酸化反應，以便同時調(diào)節(jié)其他一些轉(zhuǎn)錄因子的活性，如Elk-1、NF-κB、IL-1、c-Jun、c-fos、ATF、AP-1、TNF-α等，使其基因轉(zhuǎn)錄改變，進而調(diào)節(jié)各自蛋白基因表達發(fā)生，最終可以引起細胞的物質(zhì)能量代謝過程和生理生化功能水平的變化，導致特定生物學效應的產(chǎn)生〔11〕。周丹等〔12〕發(fā)現(xiàn)在全身炎癥過程中，ERK信號通路參與脊髓中細胞信號的轉(zhuǎn)導過程，且主要表達于小膠質(zhì)細胞，表明ERK這條信號通路參與小膠質(zhì)細胞的炎癥應答過程。趙明等〔13〕的研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2通路能被TNF-α強烈激活，通過對轉(zhuǎn)錄因子的作用而影響TNF-α的產(chǎn)生和生物學效應。姜勇等〔14〕的研究發(fā)現(xiàn)，ERK、p38和JNK三條通路的激活可能參與了脂多糖(LPS)刺激引起的TNF-α啟動子轉(zhuǎn)錄活性增加機制，它們的協(xié)同效應共同發(fā)揮了對TNF-α基因表達的調(diào)控。本實驗結果顯示，電針可以降低魚藤酮誘導的PD模型大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)ERK1/2信號通路的表達水平，同時降低炎性因子TNF-α的表達。

綜上所述，電針對PD病模型大鼠癥狀的改善可能與其抑制炎性反應早期大鼠黑質(zhì)區(qū)ERK1/2的磷酸化密切相關，并可能通過抑制ERK1/2的活化達到減少TNF-α的結果。

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〔2014-05-22修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of electroacupuncture on ERK1/2 signaling pathway of substantia nigra cells of rotenone-induced rats model with Parkinson＇s disease

WANG Shu-Ju，MA Jun，WANG Yan-Chun，et al．
College of Acupuncture＆Orthopedics，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，Hubei，China

【Abstract】Objective To observe the effect of electroacupuncture(EA)on ERK1/2 signaling pathway and inflammatory cytokines TNF-α in substantia nigra(SN)cells of rotenone-induced rats model with Parkinson＇s disease(PD)，and explore the mechanism of EA on PD．Methods A total of 32 male SD rats were randomly and averagely divided into normal，sham-operation，model and EA groups．Model and EA groups were injected intradermally with rotenone(dissolved in DMSO and saline in certain percentage)on the nape of the neck for 14 d to establish PD model rats．Behavioral assessment was conducted after the establishment of PD rats model．EA group was applied to "Fengfu" and "Taichong" points for 20 min once daily for 14 d．Other groups were not given treatments．After the treatments，the rats were killed for sampling substantia nigra tissue to detect the number of TH，p-ERK1/2 and TNF-α positive cells by inmmuno-histochemistry．Results Rats in each group performed differently in neurobehavior．Compared with normal and sham-operation groups，the expressions of TH positive cells were significantly reduced in model group(P＜0．05)，the expressions of p-ERK1/2 and TNF-α positive cells were significantly increased in model group(P＜0．05)．Compared with that of model group，the expression of TH positive cells was significantly increased in EA group(P＜0. 05)，the expressions of p-ERK1/2 and TNF-α positive cells were significantly reduced in EA group(P＜0．05)．Conclusions EA therapy might reduce the expression of TNF-α in SN of PD rats by regulating the expression of p-ERK1/2(MAPK pathway)，which might delay the process of PD．

【Key words】Parkinson＇s disease; Electroacupuncture; MAPK/ERK1/2; TNF-α; Tyrosine hydroxylase

通訊作者:馬駿(1964-)，女，教授，博士，主要從事針灸防治腦病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

基金項目:國家自然科學基金項目(No．81273863);湖北省自然科學基金計劃項目(No．2013CFB066);湖北省教育廳科研項目(No．Q20121608);湖北省教育廳高等學校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊計劃項目(No．T201308)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5694-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 007

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R749

第一作者:王述菊(1977-)，女，副教授，博士，主要從事針灸防治腦病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。