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        天麻多糖對H22荷瘤小鼠細(xì)胞周期及caspase蛋白活性的影響

        2015-12-15 15:20:34劉現(xiàn)輝郭曉娜展俊平謝忠禮王君明張?jiān)绿訇愑颀埨顣员?/span>河南省中醫(yī)院河南鄭州45000
        中國老年學(xué)雜志 2015年20期
        關(guān)鍵詞:天麻多糖腫瘤

        劉現(xiàn)輝 郭曉娜展俊平 謝忠禮王君明張?jiān)绿訇愑颀埨顣员?河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 45000)

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        天麻多糖對H22荷瘤小鼠細(xì)胞周期及caspase蛋白活性的影響

        劉現(xiàn)輝郭曉娜1展俊平謝忠禮2王君明2張?jiān)绿?陳玉龍2李曉冰2
        (河南省中醫(yī)院,河南鄭州450002)

        〔摘要〕目的探討天麻多糖對H22荷瘤小鼠細(xì)胞周期及caspase蛋白活性的影響。方法右側(cè)腋窩接種H22腫瘤細(xì)胞制造荷瘤小鼠模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)模型組、高劑量天麻多糖組、中劑量天麻多糖組、低劑量天麻多糖組及環(huán)磷酰胺(CTX)組。造模后給予天麻多糖或環(huán)磷酰胺治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠,比較各組瘤重、抑瘤率、caspase-3,8,9及細(xì)胞周期分布狀況。結(jié)果天麻多糖可明顯減輕瘤重,高劑量天麻多糖抑瘤率可達(dá)44. 7%;與模型組比較,天麻多糖中、高劑量組可顯著升高caspase-3,8,9水平及G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù),降低G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。結(jié)論天麻多糖對H22荷瘤小鼠具有顯著的抑瘤作用,其作用機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期分布,抑制細(xì)胞增殖并激活Caspase系統(tǒng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

        〔關(guān)鍵詞〕天麻;多糖;腫瘤

        1黃河科技學(xué)院2河南中醫(yī)學(xué)院3廣州中醫(yī)藥大學(xué)

        第一作者:劉現(xiàn)輝(1978-),男,主治醫(yī)師,碩士,主要從事免疫藥理學(xué)研究。

        天麻屬蘭科多年生草本寄生植物,以地下塊莖入藥,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、降壓、抗炎、抗氧化、延緩衰老等作用〔1〕。天麻中含有天麻素、赤箭苷、胡蘿卜苷、天麻多糖、腺嘌呤、腺嘌呤核苷、多種氨基酸等活性成分〔2〕。目前國內(nèi)外對天麻化學(xué)成分報(bào)道較多的是酚類中的天麻素?和多糖類中的天麻多糖,天麻素和天麻多糖也是目前已知的天麻中的主要活性成分。研究表明,天麻多糖具有免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、降低血壓、抑制病毒和抗抑郁等作用〔3〕。本研究旨在觀察天麻多糖對H22荷瘤小鼠細(xì)胞周期及caspase蛋白活性的影響。

        1 材料與方法

        1. 1實(shí)驗(yàn)動物健康雄性BALB/C小鼠,18~22 g,由河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供; H22肝癌細(xì)胞(H22)株,由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所藥理室提供。

        1. 2主要藥物及試劑天麻多糖由西安慧科生物公司提供,批號20120620,純度96. 5%;環(huán)磷酰胺(CTX)由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn),批號120706; caspase-3,8,9活性檢測試劑盒購于深圳晶美生物工程有限公司;碘化丙啶(PI)購于上海生工生物技術(shù)有限公司。

        1. 3動物模型及分組將H22腹水瘤小鼠乳白色濃稠腹水用生理鹽水稀釋至2×106個(gè)/ml且活細(xì)胞數(shù)大于95%,取0. 2 ml接種于健康小鼠右腋皮下。接種后按隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、CTX組、天麻多糖高劑量組、中劑量組及低劑量組。每組12只。

        1. 4給藥方法于造模后第2天各實(shí)驗(yàn)組開始用藥。多糖高、中、低劑量組分別按320、160、80 mg/kg天麻多糖灌胃給藥,1次/d,連續(xù)14 d; CTX組:按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果CTX 15 mg·kg-1· d-1灌胃給藥,1次/d,共10 d;模型組灌胃同體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第15天處死各實(shí)驗(yàn)組小鼠,無菌完整剝離腫瘤組織,用于瘤重稱量、caspase活性測定及細(xì)胞周期分析。

        1. 5檢測指標(biāo)與方法

        1. 5. 1天麻多糖對H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響于造模后第15天處死小鼠,剝離腫瘤組織,用濾紙吸干后稱重。腫瘤抑制率(%)=〔(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型對照組平均瘤重〕×100%〔4〕。

        1. 5. 2 caspase-3,8,9活性測定將腫瘤組織置于培養(yǎng)皿中,用手術(shù)剪剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊,加入冰冷的裂解緩沖液,冰上制備勻漿,勻漿后12 000 r/min離心20 min,取上清液,按照試劑盒操作要求檢測腫瘤組織中caspase-3,8,9活性。

        1. 5. 3細(xì)胞周期的測定瘤組織剪碎并研磨,采用200目過濾網(wǎng)過濾后制成單細(xì)胞懸液并用PBS漂洗,1 000 r/min離心后棄上清細(xì)胞重懸于預(yù)冷的75%乙醇中,-20℃固定24 h,常規(guī)PI染色后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。

        1. 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x ±s表示,采用SPSS15. 0軟件行單因素方差分析、最小顯著差法檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2. 1天麻多糖對荷瘤鼠抑瘤率的影響與模型組〔(1. 05± 0. 21)g〕相比,各用藥組瘤重明顯減輕,CTX組瘤重〔(0. 43± 0. 11)g〕與模型組相比有極顯著差異(P<0. 01),天麻多糖中、高劑量組與模型組相比瘤重減輕〔(0. 62±0. 15)、(0. 48± 0. 09)g〕(P<0. 05)。低劑量天麻多糖組瘤重(0. 73±0. 16)g。CTX組抑瘤率為59%,高劑量天麻多糖抑瘤率為44. 7%,低、中劑量天麻多糖抑瘤率為20. 9%、31. 4%。

        2. 2天麻多糖對荷瘤鼠caspase-3,8,9水平的影響與模型組比較,天麻多糖低劑量組明顯升高casepase-3,8水平(P<0. 05),顯著升高caspase-9合成(P<0. 01);天麻多糖中、高劑量組及CTX組顯著升高caspase-3,8,9水平,與模型組比較有極顯著意義(P<0. 01)。見表1。

        2. 3天麻多糖對荷瘤鼠細(xì)胞周期的影響與模型組比較,天麻多糖中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加(P<0. 05),而CTX組G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著降低(P<0. 01)。天麻多糖各劑量組S期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)。天麻多糖中、高劑量組G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降(P<0. 05),環(huán)磷酰胺組與模型組比較,G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著升高(P<0. 01)。見表2。

        表1 天麻多糖對荷瘤鼠caspase-3,8,9水平的影響(x ±s,n=12)

        表2 天麻多糖對荷瘤鼠細(xì)胞周期的影響(x±s,n=12)

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,天麻多糖可抑制H22移植瘤的生長且呈劑量依賴性。腫瘤細(xì)胞的死亡主要通過凋亡和壞死兩個(gè)途徑完成,在細(xì)胞凋亡過程中,caspase家族的激活起著關(guān)鍵作用。按不同caspase家族成員分子結(jié)構(gòu)和激活順序,通常將其分為細(xì)胞凋亡的起動因子(caspase-8/-9)和執(zhí)行分子(caspase-3/-6/-7)。細(xì)胞凋亡中最關(guān)鍵的步驟是caspase-3的激活〔5〕,其中caspase-8和caspase-9是caspase-3的重要上游激活因子。caspase-8可通過死亡受體途徑激活caspase-3,而caspase-9可通過線粒體途徑活化caspase-3,活化后的caspase-3可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔6,7〕。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)天麻多糖可顯著升高caspase-3,8,9水平,說明天麻多糖誘導(dǎo)H22肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與促使細(xì)胞線粒體caspase級聯(lián)反應(yīng)途徑活化有關(guān)。

        完整的細(xì)胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)、有絲分裂期(M期)和休眠期細(xì)胞(G0期)。在真核細(xì)胞一系列細(xì)胞周期檢測點(diǎn)中,G1/S期檢測點(diǎn)至關(guān)重要,細(xì)胞在該檢測點(diǎn)時(shí)對各類生長因子、分裂原以及DNA損傷等復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外信號進(jìn)行整合和傳遞,決定細(xì)胞進(jìn)行分裂、發(fā)生凋亡或進(jìn)入G0期,許多抗癌藥物都是通過抑制此關(guān)鍵點(diǎn)而起調(diào)節(jié)作用〔8〕。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)天麻多糖使機(jī)體G0/G1期腫瘤細(xì)胞百分比增加,G2/M期腫瘤細(xì)胞百分比下降,對S期細(xì)胞百分比影響不大,表明天麻多糖抑制腫瘤細(xì)胞增殖主要是通過阻止腫瘤細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期,防止其堿基被復(fù)制延緩細(xì)胞周期進(jìn)程,使細(xì)胞的增殖速度減慢,達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。CTX使G0/G1期和S期細(xì)胞百分比下降,G2/M期細(xì)胞百分比增加,說明其主要阻止了G2/M期細(xì)胞向G1期的轉(zhuǎn)變。綜上所述,天麻多糖可以抑制H22移植瘤的生長,這可能與天麻多糖阻止腫瘤細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期,延緩細(xì)胞周期進(jìn)程及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

        4參考文獻(xiàn)

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        3陳芳,杜娟,張秉華.天麻多糖的理化性質(zhì)和藥理活性研究〔J〕.現(xiàn)代中醫(yī)藥,2009; 29(6): 71-3.

        4 Sun GP,Wang H,Xu SP,et al.Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production〔J〕.Eur J Pharmacol,2008; 584: 246-52.

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        7 Zeiss CJ,Neal J,Johnson EA. Caspase -3 in postnatal retinal development and degeneration〔J〕.Invest Ophthamol Vis Sci,2004; 45(3): 964-70.

        8 Bartek J,Lukas J. Mammalian G1and S phase checkpoints in response to DNA damage〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2001; 13(6): 738-47.

        〔2014-09-04修回〕

        (編輯郭菁)

        The effects of Polysaccharide from Gastrodia Elata B1 on cell cycle and caspase proteins activity in H22 tumor bearing mice

        LIU Xian-Hui,GUO Xiao-Na,ZHAN Jun-Ping,et al.
        Henan Traditional Chinese Medicine Hospital,Zhengzhou 450002,Henan,China

        【Abstract】Objective To observe the effects of Gastrodia Elata B1 Polysaccharide on cell cycle and caspase-3,8,9 activities in H22 tumor bearing mice.Methods Sixty mice were randomly divided into model,CTX,Gastrodia Elata B1 polysaccharide high,middle,low groups.Two weeks later,tumor weight of mice,tumor inhibition rate,caspase 3,8,9 activities and cell cycle were inspected respectively.Results Gastrodia Elata B1 Polysaccharide decreased tumor weight significantly,tumor inhibition rate in Gastrodia Elata B1 polysaccharide high group got 44.7%.Compared with those of model group,polysaccharide in middle and high groups increased caspase-3,8,9 activities and percent of G0/G1phase cells,decreased percent of G2/M phase cells.Conclusions Gastrodia Elata B1 polysaccharide has obvious anti-tumor effect on H22 tumor bearing mice.The mechanism might be related to regulating the cell cycle distribution,inhibiting the cell proliferation and activating the caspase system to induce apoptosis.

        【Key words】Gastrodia Elata B1; Polysaccharide; Tumor

        通訊作者:李曉冰(1980-),女,講師,博士,主要從事多糖免疫藥理學(xué)研究。

        基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(No.81173177);中國博士后科學(xué)基金(2012M521412);河南中醫(yī)學(xué)院2010博士基金(BSJJ2010-10)

        〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5681-02;

        doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 001

        〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

        〔中圖分類號〕R285. 5

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