王笑庸，牛彥波.2，殷博,2，安琦,2，吳皓瓊,2

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150090）

生物肥料生產(chǎn)菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥降解能力的比較研究

王笑庸1，牛彥波1.2，殷博1,2，安琦1,2，吳皓瓊1,2

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150090）

比較了20株生物肥料生產(chǎn)菌對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解能力，經(jīng)反復(fù)馴化，確定P05解磷蠟樣芽孢桿菌（Bacillus Cereus）和SbM10解磷枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）2株菌具有較強(qiáng)的降解有機(jī)磷農(nóng)藥樂果、氧樂果的能力。

生物肥料；菌株；降解；有機(jī)磷農(nóng)藥

有機(jī)磷農(nóng)藥在我國(guó)應(yīng)用最多最普遍，占據(jù)農(nóng)藥市場(chǎng)的70%以上份額，是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中最嚴(yán)重的污染源之一。作為治理農(nóng)藥殘留的眾多技術(shù)之一，微生物技術(shù)以安全環(huán)保、經(jīng)濟(jì)高效的特性一直是關(guān)注研究的熱點(diǎn)。有機(jī)磷農(nóng)藥降解微生物的篩選方法較多，目前最常用的是從接觸有機(jī)磷農(nóng)藥的土壤或者底泥中采集樣品，經(jīng)富集培養(yǎng)、馴化或誘變等獲取高效降解菌株。由于是在實(shí)驗(yàn)條件下液體純培養(yǎng)條件下開展研究，與田間應(yīng)用存在較大差異，限制了農(nóng)藥降解菌實(shí)際應(yīng)用[1-2]。故此，本項(xiàng)目組選擇20株生物肥料生產(chǎn)菌作為篩選對(duì)象，以樂果為靶目標(biāo)，通過馴化，比較各菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的能力，旨在探尋生物肥料作為農(nóng)藥降解菌劑在實(shí)際應(yīng)用中的可能性。

1　材料

1.1菌種

巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)P01-P04；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus Cereus）P05-08；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）SbM09-10；側(cè)孢芽孢桿菌（Bacillus Laterospore）P11；克雷伯氏菌(Klebsiella)P12；硅酸鹽細(xì)菌（Bacillusmucilaginosus）K01-08。共20株菌，皆有解磷作用，作為解磷菌或解鉀細(xì)菌應(yīng)用于微生物肥料的生產(chǎn)，項(xiàng)目組分離，保藏。

1.2培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基A（NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2SO 4·7H2O 0.5g，CaCl20.1g，F(xiàn)eSO40.01g，MnSO40.001g，H2O 1 000 mL）和無機(jī)鹽培養(yǎng)基B（K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO4 0.5g，NaCl 0.2g，CaCl20.1g，MnSO40.001g，F(xiàn)eSO40.001g，（NH4）2SO4 1.0g,H2O 1 000 mL）；

分離、富集培養(yǎng)：LB肉湯培養(yǎng)基、Ashby固氮培養(yǎng)基、PDA土豆汁培養(yǎng)基。

1.3試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為分析純。

2　試驗(yàn)內(nèi)容和方法

2.1菌株的馴化

挑取2～3環(huán)菌苔于40mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基A中，依5‰比例加入樂果，30℃、180r/min，培養(yǎng)48～72h。觀察培養(yǎng)液的渾濁度，判斷菌株是否有存活生長(zhǎng)，同時(shí)在LB肉湯培養(yǎng)基或Ashby固氮培養(yǎng)基劃線分離，挑取單菌落，復(fù)接于5‰樂果的無機(jī)鹽培養(yǎng)基A中，30℃培養(yǎng)，進(jìn)行馴化，反復(fù)3次，選擇生長(zhǎng)旺盛的菌株，保存。

2.2菌株的復(fù)篩

將馴化的菌株接于40mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基B中，依5‰比例加入樂果，30℃、180r/min培養(yǎng)48h。吸取5mL轉(zhuǎn)接于新鮮的無機(jī)鹽培養(yǎng)基B中，依7‰～9‰比例加入樂果，培養(yǎng)并判斷菌株是否存活、生長(zhǎng)，同時(shí)在含7‰樂果的無機(jī)鹽培養(yǎng)基B和PDA土豆汁培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)好的菌株，進(jìn)行降解能力的比較。

2.3菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥能力的比較

將復(fù)篩優(yōu)選的4株菌活化18h后，接種于含5‰樂果的無機(jī)鹽培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)72h。于發(fā)酵液加入適量的無磷活性炭脫色，12 000r/min低溫離心，取上清液2～10mL（含5～25mg磷）進(jìn)行無機(jī)磷含量的測(cè)定，以確定降解有機(jī)磷農(nóng)藥效果最好的菌株。采用鉬銻鈧比色法進(jìn)行無機(jī)磷含量的測(cè)定，方法參見-2000磷細(xì)菌肥料。不接菌的培養(yǎng)液作對(duì)照(CK)。

2.4復(fù)篩菌株P(guān)05、SbM 10菌株降解樂果、氧化樂果的能力分析

將復(fù)篩菌株接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按1%比例分別接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基B和LB中，按2‰～8‰比例分別加入不同量樂果和氧化樂果，培養(yǎng)48～72h測(cè)定培養(yǎng)液中農(nóng)藥殘留量，計(jì)算降解率。樂果、氧化樂果含量測(cè)定：取發(fā)酵液10mL，加入20 mL乙腈、2gNacl充分震蕩，靜止30min，取10mL有機(jī)相，80℃水浴蒸發(fā)至干，加10mL丙酮溶解，氣象色譜測(cè)定。測(cè)定方法見中國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 761-2008。

3　結(jié)果與分析

3.1菌株的馴化與復(fù)篩

在以樂果作為唯一碳源和能源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，各菌經(jīng)過3次馴化，除2株菌（蠟狀芽孢桿菌P06、P08）不能利用樂果生長(zhǎng)外，其余18株菌，皆能生長(zhǎng)。復(fù)篩結(jié)果見表1?？梢姡杷猁}細(xì)菌（鉀細(xì)菌）沒有降解有機(jī)磷農(nóng)藥的能力；解磷巨大芽孢桿菌P03、蠟狀芽孢桿菌P05、枯草芽孢桿菌SbM09、SbM10 4株菌生長(zhǎng)最好，說明能利用樂果生長(zhǎng)。

3.2菌株降解能力的比較

結(jié)果見表2。從表2可見，SbM-10的枯草孢桿菌和P05蠟樣芽孢桿菌對(duì)樂果的降解能力最強(qiáng)，降解產(chǎn)物無機(jī)磷的含量分別達(dá)到0.413mg/L、0.45 mg/L，故選擇這2株菌開展深入研究。

表1　復(fù)篩菌株生長(zhǎng)狀況Tab.1 Secondary screening of strains growth conditions

表2　4株菌降解能力比較Tab.2 Comparison of 4 strains degradation Ability

3.3復(fù)篩菌株P(guān)05、SbM-10降解樂果、氧化樂果的能力分析

結(jié)果見圖1。從圖1可知，在含2‰～8‰樂果濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)48h,SbM 10、P05對(duì)樂果降解率分別為85.6%～93.08%和75.77%～91.59%；隨著農(nóng)藥濃度的增加，菌的生長(zhǎng)受到抑制；氧化樂果的降解試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可知，這2株菌對(duì)氧化樂果均有明顯的降解能力，72h測(cè)定，在含樂果2‰、4‰無機(jī)鹽培養(yǎng)基B中，SbM10和P05對(duì)氧化樂果的降解率分別是79.78%、73.59%和63.55%、79.89%；在LB中前者高達(dá)91.49%～84.97%，后者達(dá)93.12%～75.54%。菌株在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)數(shù)量遠(yuǎn)高于無機(jī)鹽培養(yǎng)基，說明在富營(yíng)養(yǎng)條件下，菌株對(duì)農(nóng)藥的抗性增加，降解農(nóng)藥的效果更佳。

圖1　在無機(jī)鹽B中菌株對(duì)樂果的降解效果Fig.1Strains degradation effects on dimethoate in inorganic salt medium B

表3　菌株在無機(jī)鹽B及LB肉湯培養(yǎng)基中對(duì)氧化樂果的降解效果Tab.3 The degradation rate of strains in inorganic salt medium B and LB broth medium to omethoate

4　結(jié)論與討論

本項(xiàng)目以微生物肥料生產(chǎn)菌（解磷細(xì)菌、硅酸鹽細(xì)菌）作為篩選對(duì)象，優(yōu)選出2株具有較高降解能力的菌株：P05解磷蠟樣芽孢桿菌和SbM-10解磷枯草芽孢桿菌，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥和氧化樂果都有較強(qiáng)的降解能力，優(yōu)于或等同于目前文獻(xiàn)報(bào)道的其他菌株的降解能力［2-8］；為生物肥料在農(nóng)藥降解上的應(yīng)用提供理論依據(jù)，將進(jìn)一步對(duì)有關(guān)上述2株菌的降解機(jī)理以田間應(yīng)用情況加以深入研究。

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Comparative Study of Bio-fertilizer Production Strains to Organophosphorus Pesticide Degradation Ability

WANGXiao-yong1;NIUYan-bo1.2;YINBo1.2,ANQi1.2,WUHao-qiong1.2
(1.Institute ofMicrobiology,HAS.,Harbin 150010,China;
2.Institute ofAdvanced Technology,HAS.,Harbin 150090,China)

The study has compared the degradation ability of 20 production strains of bio-fertilizer production to organophosphorus pesticide. After repeated domesticated,the study concluded that 2 strains of P05 phosphate solubilizingBacillusCereus and SbM10 phosphate solubilizing Bacillussubtilis had a strongdegradation abilitytoOrganophosphorus pesticide dimethoate and omethoate.

Bio-fertilizer;Strain;Degradation;Organophosphorus pesticide

X172

A

1674-8646（2015）09-0026-03

2015-06-12

黑龍江省院所基本技術(shù)研究專項(xiàng)“有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌劑在溫（棚）室蔬菜上的應(yīng)用研究”（SW201314）

王笑庸（1975-），女，黑龍江大慶人，碩士，工程師，從事科技管理工作。

吳皓瓊（1968-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，研究員，從事農(nóng)業(yè)微生物研發(fā)工作，e-mail：wuhaoqiong@163.com。