袁 敏 ，趙桂蘭，龐世敏

(1.華南師范大學(xué)實驗中心，廣州510006;2.華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣州510006)

高等植物體內(nèi)存在著茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)，是一類具有防御機制的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子. MeJA 能夠誘導(dǎo)植物防御基因的表達，抵御病原菌、真菌及昆蟲等生物的侵害.同時，MeJA 還能調(diào)控對機械傷害、鹽害及紫外線照射等非生物脅迫的反應(yīng)［1－3］. 茉莉酸甲酯在植物組織中含量的自然基準(zhǔn)水平為10 ～100 ng/g［4］.

茉莉酸甲酯在植物體中微量存在，很容易被植物中大量揮發(fā)物掩蓋導(dǎo)致無法測出，所以需要研究探討不同類型植物中茉莉酸甲酯的測定方法. 有報道采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定小麥、黑麥草穎花中及煙草葉中茉莉酸甲酯含量［5，6］，這些方法需經(jīng)過繁瑣的前處理過程. 有文獻報道應(yīng)用氣相色譜－化學(xué)電離－質(zhì)譜聯(lián)用(GC-CI-MS)［7］測定茉莉花瓣中的茉莉酸甲酯，用反相液相色譜－氣相色譜聯(lián)用(RPLC-GC)［8］分離鑒定檸檬精油中的茉莉酸甲酯，這2 種方法要對植物樣品進行提取、純化、濃縮.固相微萃取(SPME)是集萃取、濃縮、進樣為一體的一種新型萃取技術(shù)，所需樣品量少、損耗小，適用于復(fù)雜體系中痕量揮發(fā)性有機化合物的測定［9－11］.雖然有文獻報道固相微萃取(SPME)作為前處理方式分離鑒定茉莉鮮葉中的茉莉酸甲酯及測定擬南芥葉、西紅柿葉中茉莉酸甲酯的含量［12－13］］，但由于不同植物所含揮發(fā)組分不同，大豆根樣品水分含量高，揮發(fā)性組分較多，茉莉酸甲酯含量較少且易揮發(fā)，常規(guī)的前處理方法難以測定. 本實驗采用HS-SPME-GC-MS 定性、HS-SPME-GC 定量測定大豆根中微量茉莉酸甲酯，并通過優(yōu)化萃取時間、萃取溫度、解吸溫度及離子強度等實驗參數(shù)提高檢測靈敏度，建立了一套快速、靈敏、高效檢測大豆根中內(nèi)源茉莉酸甲酯含量的新方法.該方法無需溶劑，所需樣品量少，前處理方法簡便，能有效測定在大豆根中微量內(nèi)源茉莉酸甲酯含量，為研究植物根中內(nèi)源茉莉酸甲酯的變化提供了很好的測試手段.

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

FINNIGAN Trace GC Ultra-Trace DSQ 氣質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo ELECTRON CORPORATION). 9890 A氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器(FID)(上海靈華儀器有限公司)，SE-54 石英毛細管柱(30 m ×0.25 mm×0.25 μm，中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所色譜技術(shù)研究開發(fā)中心)，千譜2000 色譜數(shù)據(jù)工作站(上海千譜軟件有限公司)，手動固相微萃取裝置(50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，美國Supelco 公司)，15 mL 頂空瓶(自備)，頂空瓶專用硅橡膠隔墊(安捷倫科技有限公司).

茉莉酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品1 000 mg/L (ALORICH)，甲醇配，使用時按需要稀釋).出芽8、10、12、14、16 d 的大豆植株系列，由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(種子生物學(xué)實驗室)提供，所有試劑均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取 先將固相微萃取纖維頭在GC 進樣口老化1 h (250 ℃)，取新鮮大豆植株洗凈吸干表面水分，剪取大豆根準(zhǔn)確稱量0.500 0 g，剪碎后裝入15 mL 頂空瓶(瓶中預(yù)先加入0.9 mL質(zhì)量分數(shù)為30% NaCl，用專用頂空硅橡膠隔墊封口.快速損傷會產(chǎn)生茉莉酸甲酯，所以新鮮大豆根樣品剪碎后立即進行測定. 樣品在90 ℃預(yù)熱20 min后在90℃水浴恒溫下用手動固相微萃取裝置頂空萃取20 min，在GC 進樣口(250 ℃)脫附2 min，同時進行GC-MS、GC-FID 檢測.

1.2.2 色譜、質(zhì)譜條件 色譜柱溫度:40 ℃保持5 min，以30 ℃/min 升至100 ℃，再以5 ℃/min 升至230 ℃，進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度300 ℃，載氣N2線速度:25 cm/s，H2:30 mL/min，空氣:300 mL/min，He 氣流速1 mL/min，掃描電壓:70 MeV，離子源溫度:250 ℃，傳輸線溫度:230 ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

固相微萃取過程是一個富集平衡的過程，萃取時間、萃取溫度、解吸時間及離子強度等都是影響萃取效率的重要因素.在本實驗中，大豆根的水分含量高，揮發(fā)物較復(fù)雜，蒸發(fā)出來的水分會影響萃取效率，所以優(yōu)化實驗參數(shù)是實驗成敗的關(guān)鍵. 選用50/30μm DVB/CAR/PDMS 型的萃取纖維頭，按照2.2.2 色譜條件測試不同萃取時間、萃取溫度、解吸時間以及離子強度對大豆根中茉莉酸甲酯萃取量的影響.

2.1.1 萃取溫度的影響 提高萃取溫度可以加速分子運動，使被萃取物質(zhì)較快脫離基質(zhì)形成氣態(tài)，有利于萃取.但溫度過高會使被萃取物質(zhì)發(fā)生高溫反應(yīng)和解吸效應(yīng)，本實驗室觀察到大豆根中水分蒸發(fā)過多降低萃取效率. 選擇不同萃取溫度(60、70、80、90、95 ℃)對大豆根材料中的MeJA 水平測定，結(jié)果表明(圖1)，60 ～90 ℃時，隨著萃取溫度的升高，色譜峰面積增加，90 ℃達到最高值，超過90 ℃，萃取效率開始下降，樣品中揮發(fā)組分析出量增多，水分溢出急劇增加，影響微萃取頭的吸附，同時萃取頭的解吸效應(yīng)提高，使萃取效率降低，因此選擇最適宜的萃取溫度為90 ℃.

圖1 萃取溫度對大豆樣品的MeJA 萃取效率的影響Figure 1 Effects of extraction temperature on extraction efficiency of methyl iasmonate in soybeans

2.1.2 萃取時間的影響 分配平衡常數(shù)、試樣體積和涂層體積、萃取時間影響涂層萃取量，在未達到分析平衡前，涂層萃取量隨時間增加而增加.圖2 顯示20 min 前，隨著萃取時間延長，萃取量增加. 萃取時間到達20 min 后萃取效率逐漸降低，說明萃取頭有一定的飽和度，當(dāng)達到平衡時，延長萃取時間萃取頭不但不吸附，反而會使萃取頭的吸附物損失，因此選擇20 min 為最佳萃取時間.

圖2 萃取時間對大豆樣品的MeJA 萃取效率的影響Figure 2 Effects of extraction time on extraction efficiency of methyl jasmonate in soybeans

2.1.3 解吸時間的影響 解吸時間為2 min 時峰面積達到最大值，2 min 后，峰面積逐漸下降趨于平衡(圖3)，說明解吸時間2 min 已完全解吸萃取頭中的提取物，因此選擇2 min 為最佳解吸時間.

圖3 解吸時間對大豆樣品的MeJA 萃取效率的影響Figure 3 Effects of desorption time on extraction efficiency of methyl jasmonate in soybeans

2.1.4 離子強度的影響 為了考察不同加鹽量對萃取量的影響，研究不同質(zhì)量分數(shù)的NaCl 溶液對大豆根材料中MeJA 的影響(圖4). 在加入0 ～30%NaCl 時，樣品峰面積隨著無機鹽量的增加而增加.因為無機鹽有一定的溶解度，因此選擇30% NaCl溶液為實驗條件.

2.2 大豆根部內(nèi)源MeJA 檢測

2.2.1 實際樣品定性測定 按照2.2 實驗方法對生長期為8、10、12、14 和16 d 的系列大豆植株根部內(nèi)源茉莉酸甲酯進行GC-FID 測定(圖5)，并用GCMS 進行了確證(圖6).從圖5 可以看到大豆根中揮發(fā)組分比較復(fù)雜，茉莉酸甲酯含量很少.所以必須要選擇合適的萃取條件和分離條件，才能檢出大豆根中的內(nèi)源MeJA.

圖4 離子強度對大豆樣品的MeJA 萃取效率的影響Figure 4 Effects of ionic strength on extraction efficiency of methyl jasmonate in soybeans

圖5 大豆根中MeJA 的氣相色譜圖Figure 5 Gas chromatogram of methyl jasmonate in roots of soybeans

2.2.2 線性范圍、檢出限及實際樣品定量測定 配制0.5、1、5、10、25、50 μg/L 茉莉酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行色譜分析，以峰面積y、質(zhì)量濃度x 得到線性回歸方程為:y =2 104x +1 627.2，R2=0.993 8，測出線性范圍為0.7 ～25 μg/L，最低檢測限為0.5 μg/L.按照公式(1)換算得出實際樣品的線性范圍是2.1 ～750 ng/g，最小檢測量是1.5 ng/g. 植物組織中茉莉酸甲酯含量的自然基準(zhǔn)水平是在10 ～100 ng/g 之間，故本實驗的線性范圍完全滿足實際樣品的測定.換算樣品中茉莉酸甲酯的含量的公式如下:

其中x 表示標(biāo)準(zhǔn)曲線中茉莉酸甲酸的質(zhì)量濃度(μg/L).

根據(jù)線性回歸方程及茉莉酸甲酯含量的計算公式，得出大豆植株在生長期為8、10、12、14、16 d 時根部受損內(nèi)源產(chǎn)生的茉莉酸甲酯的含量，3 次平行實驗所得結(jié)果的平均值(圖7)顯示，大豆根樣品中內(nèi)源茉莉酸甲酯的含量隨著生長天數(shù)增加呈現(xiàn)出下降－上升－下降－上升的波動趨勢.

圖6 大豆根中茉莉酸甲酯的質(zhì)譜圖及茉莉酸甲酯的結(jié)構(gòu)Figure 6 The mass spectrum and chemical structure of methyl jasmonate in roots of soybeans

圖7 茉莉酸甲酯測定結(jié)果Figure 7 Determination results of methyl jasmonate

2.2.3 精密度及回收率實驗 準(zhǔn)確稱量0.500 0 g樣品各10 份，1 份作為空白對照，另9 份采用添加法在實際樣品中添加不同濃度的茉莉酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行了精密度和加標(biāo)回收實驗. 結(jié)果(表1)表明:茉莉酸甲酯的加入量小于500 ng 時，回收率比較高，但加入量增加到1 000 ng 時，回收率明顯下降，說明微萃取頭吸附量是有限的，當(dāng)被萃取物濃度超過其萃取量時，會由于樣品不能完全吸附導(dǎo)致出峰面積下降.

表1 加標(biāo)回收實驗結(jié)果Table 1 Results of recovery rates experiments

3 結(jié)論

本實驗選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 型的萃取纖維頭，對大豆根樣品中微量茉莉酸甲酯進行富集，樣品使用量可減少到0.5 g. 選擇合適的色譜分離條件可使MeJA 在復(fù)雜的有機揮發(fā)物中得到有效分離檢測，選用GC-MS 鑒定MeJA，GC 進行優(yōu)化，HS-SPME 定量分析的測定.

優(yōu)化實驗參數(shù)是提高檢測靈敏度的重要手段.本實驗對影響HS-SPME 的參數(shù)進行優(yōu)化選擇，選出萃取溫度為90 ℃、萃取時間為20 min、解吸時間為2 min、質(zhì)量分數(shù)為30% NaCl 溶液為最佳萃取條件.

采用HS-SPME-GC 技術(shù)能有效測定大豆根樣品損傷后所分泌的揮發(fā)性物質(zhì)茉莉酸甲酯，方法最小檢測量為0.5 μg/L(在植物中為1.5 ng/g)，線性范圍為0.7 ～25 μg/L(在植物中為2.1 ～750 ng/g)，完全滿足植物組織中含量的自然基準(zhǔn)水平為10 ～100 ng/g.

采用該方法對大豆根樣品進行測定，發(fā)現(xiàn)大豆根樣品中內(nèi)源茉莉酸甲酯的含量隨著生長周期的變化而變化.

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