劉鳳玲李子璇聶麗娟阿呷爾布袁瑞英王聚樂

（①菏澤家政職業(yè)學院 山東菏澤274300②③④⑤⑥西藏大學醫(yī)學院 西藏拉薩850000）

藏藥二十五味珊瑚丸中馬兜鈴酸A及汞鹽等重金屬含量測定

劉鳳玲①李子璇②聶麗娟③阿呷爾布④袁瑞英⑤王聚樂⑥

（①菏澤家政職業(yè)學院 山東菏澤274300②③④⑤⑥西藏大學醫(yī)學院 西藏拉薩850000）

藏藥二十五味珊瑚丸處方中的木香在流通和使用過程中存在與含馬兜鈴酸的青木香混用現(xiàn)象。文章建立RP-HPLC法（流動相：甲醇-0.05%冰醋酸（62：38）；檢測波長：250nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min）測定處方中馬兜鈴酸A的含量，并采用2010年版《中國藥典》重金屬檢查法第二法、硫氰酸銨滴定法，分別測定了二十五味珊瑚丸處方樣品中的重金屬總量和硫化汞的含量，采用一般鑒別試驗對可溶性汞鹽進行檢查，控制其質(zhì)量，保證臨床使用安全性。馬兜鈴酸A和可溶性汞鹽在樣品中均未檢出；所檢測樣品中重金屬總含量在200～225ppm之間；硫化汞平均含量為29.75mg·g-1，RSD為0.56%。結(jié)果表明，藏藥二十五味珊瑚丸中木香的來源控制較好；重金屬總含量較高，有必要進一步分析重金屬成分是否為本品的活性必需成分以及是否具有毒性。本研究中硫氰酸銨滴定法測定硫化汞的含量方法簡便、結(jié)果準確、重復(fù)性好，可用于藏藥二十五味珊瑚丸的質(zhì)量控制。

藏藥二十五味珊瑚丸；馬兜鈴酸；重金屬；汞鹽

二十五味珊瑚丸藏藥保護品種，由珊瑚、珍珠母、訶子、木香、沉香、朱砂、龍骨、爐甘石等25味藥材組成，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·藏藥》第一冊及《中國藥典》(2010版)中，具有開竅、通絡(luò)、止痛、調(diào)和血壓之功效，臨床上用于頑固性頭痛、白脈病、腦炎、頭暈?zāi)垦！⒅w麻木僵硬、神志不清、血壓不調(diào)、抽風痙攣等病癥的治療[1]。

二十五味珊瑚丸處方中的木香（Aucklandia lappa Decne的干燥根）由于中藥常見的同名異物、名字相似等原因，在流通和使用過程中可能與含馬兜鈴酸的青木香（馬兜鈴科植物馬兜鈴Aristolochia debilisSieb. Et Zucc.的干燥根）混淆。近年來，大量國內(nèi)外研究證明該成分表現(xiàn)了強烈的致癌作用[2]和腎毒性[3-4]，因此有必要對二十五味珊瑚丸中馬兜鈴酸進行監(jiān)控，保證其臨床使用的安全性。

二十五味珊瑚丸所含朱砂（主要含HgS）、青金石（硫和氯的鈉鈣鋁硅酸鹽）、爐甘石（主要含ZnCO3）、磁

石（主要含F(xiàn)e3O）、禹余糧（主要含F(xiàn)eO(OH)）等多種礦物藥是其發(fā)揮療效的部分物質(zhì)基礎(chǔ)，然而其富含的各種重金屬元素對人體潛在的毒性也值得關(guān)注。但是其質(zhì)量標準中卻沒有重金屬相關(guān)的檢測。為了保證其臨床用藥的安全有效，本研究采用《中國藥典》重金屬檢查法第二法檢測重金屬總量，用硫氰酸銨滴定法測定硫化汞的含量，同時采用一般鑒別試驗對可溶性汞鹽進行了檢查，期望為二十五味珊瑚丸的質(zhì)量控制提供科學的依據(jù)。

1 實驗儀器和試藥

島津LC-10A高效液相色譜儀，配CLASS-VP5.03色譜工作站；色譜柱：KromasilC18（4.6mm×200mm，5μm）；北京賽多利斯BT25G電子天平（萬分之一）。

二十五味珊瑚丸（09158A）由西藏自治區(qū)藏藥廠提供；馬兜鈴酸A標準品（中國藥品生物制品檢定所，110746-200507）；朱砂，購于四川省華安堂藥業(yè)連鎖有限公司；甲醇色譜純，水為超純水（自制）；甲醇、冰醋酸均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司出品；硫氰酸銨、硝酸鉀、高錳酸鉀、硫酸亞鐵、硫酸等試藥，天津市光復(fù)精細化工研究所出品。

2 方法和結(jié)果

2.1 馬兜鈴酸A含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6×200mm）；流動相：甲醇-0.05%冰醋酸（62：38）；檢測波長：250nm；柱溫：30℃；流速：1ml/min。

2.1.2 對照品及供試品溶液制備

精密稱取5mg馬兜鈴酸A對照品，用甲醇定容至25m l容量瓶中，貯存于4℃冰箱中備用。

精密稱取二十五味珊瑚丸5g，粉碎，加入甲醇-甲酸（98：2）溶液250ml，稱定重量，水浴加熱回流1h。冷卻后，稱定重量，補足失重。過濾，水浴揮干后用甲醇-甲酸（98：2）溶解并定容至5ml容量瓶中。

2.1.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2.1.2項中所列對照品溶液各10μl，照2.1.1色譜條件進樣，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標、對照品溶液濃度（mg/ml)為橫坐標進行線性回歸，回歸方程為：y=2E+08x+729618，r= 0.9999，說明對照品進樣量在0.5305～0.9549μg間，線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限：精密吸取標準儲備液1ml，至50ml容量瓶，定容，得濃度為0.01061mg/m l的標準對照溶液。分別精密吸取該對照溶液10、8、6、4、2、1μl進樣，記錄色譜圖。以信噪比2：1作為檢測限，信噪比10：1為定量限，計算馬兜鈴酸A的最低檢測限為10.4ng，最低定量限為68.6ng。

精密度試驗：取同一對照品溶液，按2.1.1色譜條件，連續(xù)進樣6次，所得馬兜鈴酸A峰面積RSD為1.15%，表明檢測方法精密度良好。

重復(fù)性試驗：精密稱取二十五珊瑚丸粉末6份，每份5g，精密稱定，分別加入馬兜鈴酸A標準品0.2704mg，按2.1.2項制備6份供試品溶液，并按2.1.1色譜條件檢測、計算馬兜鈴酸A含量RSD，結(jié)果為2.49%，表明檢測方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗：取重復(fù)性試驗供試品溶液，按2.1.1色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24h進樣，計算馬兜鈴酸A峰面積RSD，結(jié)果為1.79%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：精密稱取5g樣品粉末各3份，分別加入馬兜鈴酸對照品0.2080、0.2704、0.3120mg，照2.1.2制備供試品溶液，按2.1.1色譜條件連續(xù)檢測3次，計算回收率（見表1）。

2.1.4 樣品測定

取二十五珊瑚丸粉末5g，按2.1.2項制成供試品溶液。另取樣品2.5g，加入馬兜鈴酸A標準品適量，按2.1.2制成供試品溶液，以2.1.1項下色譜條件測定。結(jié)果顯示，樣品中未測出馬兜鈴酸A，而加入馬兜鈴酸A標準品的藥品中馬兜鈴酸A的含量為131.25μg，與對照品加入量相當，色譜圖見圖1。

2.2 重金屬含量檢測

2.2.1 標準鉛溶液的制備

依藥典配制標準鉛溶液(10μg·m l-1)

2.2.2 樣品測定

表1 馬兜鈴酸A含量測定加樣回收試驗結(jié)果

圖1 馬兜鈴酸A及二十五味珊瑚丸樣品HPLC圖對比

取本品適量，研細，過20目篩，混勻，分取0.2g，平行操作6份，精密稱定，緩緩熾灼至完全炭化，自然冷卻，加硫酸0.5m l，使?jié)駶?，低溫加熱至硫酸除盡后，加硝酸0.5m l，蒸干，至氧化氮蒸氣除盡后，自然冷卻，在500～600℃熾灼5h，使完全灰化，自然冷卻，加鹽酸2m l，置水浴上蒸干后加水15m l，滴加氨試液至對酚酞指示液顯微粉紅色，再加醋酸鹽緩沖液（pH3.5）2m l，微熱溶解后，用G4玻砂漏斗抽濾，殘渣用少量蒸餾水洗滌，濾液及洗液合并，移置納氏比色管中，加水稀釋至25m l；另取配制供試品溶液的試劑各5份，

置瓷皿中蒸干，加醋酸鹽緩沖液（pH3.5）2m l，微熱溶解后，分別移置5支納氏比色管中，依次加標準鉛溶液3、3.5、4、4.5、5mL，再滴加少量稀焦糖溶液，并用水稀釋至25ml使之與樣品溶液一致；再在上述11支管中，分別加硫代乙酰胺試液各2m l，搖勻，放置2min，同置白紙上，自上向下透視，比較供試品管中與各標準鉛管的顏色。計算，即得本品中重金屬含量范圍，結(jié)果見表2。

2.3 硫化汞含量測定

2.3.1 硫氰酸銨滴定法

取本品適量，研細，過20目篩，混勻，精密稱定約5g，置250ml錐形瓶中，加硫酸30ml與硝酸鉀5g，加熱至溶液淡黃白色，冷卻后加人50m l水稀釋溶解。精密轉(zhuǎn)移至100m l量瓶中，用少量去離子水分次洗滌錐形瓶，后將洗液并入溶液中定容后搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液80ml，置250ml錐形瓶，滴加1%高錳酸鉀溶液至顯粉紅色，若2min內(nèi)不消失，再滴加2%硫酸亞鐵溶液，至粉紅色消失后加硫酸鐵銨指示液2m l，用硫氰酸銨滴定液（0.1mol·l-1）滴定。每1m l硫氰酸銨滴定液（0.1mol·l-1）相當于11.63mg的硫化汞（HgS）。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

取同一批號樣品5份，每份5g，精密稱定，按2.3測定法平行操作，平均含量為29.60mg·g-1，RSD為0.82%，表明重復(fù)性良好。

2.3.3 加樣回收試驗

朱砂中硫化汞含量測定：按照2010年版《中國藥典》(一部)朱砂項下含量測定方法，測得朱砂粉末中HgS含量為98.72%，RSD=0.45%（n=6），以其作為HgS對照品進行回收率試驗。

取同一批號樣品6份，各約2.5g，精密稱定，精密加入上述HgS對照品（含量98.72%),按2.3測定法平行操作，平均回收率為99.64%，RSD為1.64%，表明該方法可靠，準確度高，結(jié)果見表3。

2.3.4 樣品含量測定

取本品3份，按2.3測定方法平行操作，測定結(jié)果見表4。

表2 二十五味珊瑚丸中重金屬含量

表3 硫氰酸銨滴定法測定硫化汞的含量加樣回收試驗結(jié)果

表4 二十五味珊瑚丸中硫化汞含量

2.4 可溶性汞鹽的陰陽性檢驗

取本品適量，研細，過20目篩，混勻，取5g，加水20ml，攪勻，濾過，靜置，按《中國藥典》中汞鹽的鑒別反應(yīng)進行檢驗，汞鹽鑒別反應(yīng)呈陰性。

3 討論

參考高效液相色譜測定馬兜鈴酸A的相關(guān)方法對二十五味珊瑚丸中馬兜鈴酸A進行了測定，樣品中未測出馬兜鈴酸A。考慮到中藥成分復(fù)雜和含量微量等問題，為避免前處理過程中二十五味珊瑚丸中馬兜鈴酸A未被提取出損失、或測定過程中含量過低而未被檢出的問題，本試驗在對方法學考察的同時，假設(shè)二十五珊瑚丸中含有青木香，在制備供試品的同時，在二十五味珊瑚丸中加入一定量的馬兜鈴酸A對照品平行制備和測定樣品。結(jié)果表明，與馬兜鈴酸A對照品圖譜比較而言，未加入馬兜鈴酸A的樣品中相應(yīng)位置無馬兜鈴酸A色譜峰，而加入馬兜鈴酸A的樣品中出現(xiàn)馬兜鈴酸A色譜峰，且含量經(jīng)計算后與加入量基本一致。由此可推斷，該批二十五珊瑚丸樣品中不含馬兜鈴酸A。說明該樣品中沒有木香與青木香的混用。由于本試驗使用二十五珊瑚丸樣品數(shù)量極為有限，為了保證本品臨床使用的安全性，在生產(chǎn)過程中對原料品種、品質(zhì)嚴格控制的同時，仍然需要繼續(xù)對二十五珊瑚丸中馬兜鈴酸A進行監(jiān)控。

二十五味珊瑚丸中含有多種礦物藥品，如珊瑚、朱砂、龍骨、爐甘石、腦石、磁石、禹糧土，富含汞、鋅、鐵等重金屬元素。這些礦物類藥物既是二十五味珊瑚丸的有效成分，又是毒性成分。例如朱砂具有清心鎮(zhèn)驚，安神解毒，但現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)長期大量使用朱砂，重金屬在體內(nèi)蓄積，造成嚴重的肝、腎功能損害，并可能損害人的血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[5-7]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，朱砂的毒性成分主要是容易被人體吸收的游離汞及可溶性汞鹽，可造成多個器官的損害[8]。本試驗用硫氰酸銨滴定法測定硫化汞的含量，方法簡便、結(jié)果準確、重復(fù)性好；同時，結(jié)合一般鑒別試驗對可溶性汞鹽進行檢查，可有效控制本品中的朱砂的用量和毒性反應(yīng)。

重金屬總量檢測發(fā)現(xiàn)二十五味珊瑚丸樣品中重金屬總量達200～225ppm，遠遠超據(jù)國家商務(wù)部于2001年頒發(fā)的《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》[9]有關(guān)藥材重金屬元素限量標準（20ppm）所規(guī)定的限量要求，這些重金屬主要來源于本品中的礦物類藥。有文獻[10]報道，二十五味珊瑚丸中礦物元素主要以不溶性固態(tài)存在，占70%以上，僅少部分以有機結(jié)合態(tài)和游離態(tài)形式存在。這些重金屬是否為本品的活性必需成分以及是否對人體產(chǎn)生蓄積毒性還有待深入研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005:292-293．

[2]De Smet PA G M.Adverse effectsofherbaldrugs[J].Springer-verlag Berlin Heidelberg,1992,(1):79-89．

[3]Vanherweghem JL,Depierreux M,TielemansC,et al.Rapidly progressive intestitial renal fibrosis in young woman associ-ation w ith slimm ing regimen including Chinese herbs[J].Lancet,1993,341(13):387．

[4]李鋒,程慶礫.對13例木通中毒導(dǎo)致急性腎功能衰竭的分析[J].中國中藥雜志,1999,24(7):435．

[5]吳立明.談朱砂的功用及毒性[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(3):449-450．

[6]宋廣舜,王紹漢,李玉.環(huán)境醫(yī)學[M].天津:天津科技出版社,1987:46．

[7]錢建明.合理使用朱砂謹防汞中毒危害[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2003,11(3):18-19.

[8]廖自基.微量元素的環(huán)境化學及生物效應(yīng)(第1版)[M].北京:中國環(huán)境科學出版社,1992:347．

[9]對外貿(mào)易經(jīng)濟合作部.藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準[S].2001.

[10]應(yīng)旭輝.藏藥二十五味珊瑚丸化學成分分析及神經(jīng)護作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].天津:南開大學,2014.

Determ ination of Aristolochic Acids A and Heavy M etals in Tibetan medicine--ErshiwuweiShanhuwan

Liu Feng-ling①LiZi-xuan②N ie Li-juan③Axia-Arbu④Yuan Rui-ying⑤W ang Ju-le⑥
(①Heze Housekeeping Institute,Heze 274300,China;②③④⑤⑥MedicalCollegeof TibetUniversity,Lhasa 850000,China)

The phenomenon ofmixing useing between Saussurea lappa in the Ershiwuweiprescription and radix aristolochiae in aristolochic acid existed in their utilization and circulation.The article established amethod of RP-HPLC(Mobile phase:Methanol-0.05%Glacialacetic acid 62-38%;detection wavelength:250nm;Column temperature:30℃;flow rate:was 1.0ml/min)and detected the contend of Aristolochic Acids A in prescription, and the secondmethod for inspection ofheavymetal from"Chinese Pharmacopoeia"2010 edition and titration of Ammonium thiocyanatewere used to detect the contentsof totalheavymetals andmercury sulfide in Ershiwuwei Shanhuwan.The solublemercury saltswas inspected with general identification testand controlled its quality to ensure the safety of clinical application.Aristolochic acid A and solublemercury saltswere not detected in the sample,but the total contentofheavymetalswasbetween 200～225ppm,the average contentofmercury sulfide was29.75mg/g and RSDwas 0.56%.The resultshowed that the source of Saussurea lappa controlled well in the Ershiwuwei Shanhuwan but the total contentof heavymetalswas high.Therefore,it is necessary further analysis to detectwhether it is the active ingredientof the productor toxic substances.In this study,ammonium thiocya?nate titrationmethed used for testing the contentofmercuric sulfide is very simple and reproduciblewith accu?rate result,and itcan beused for controlingquality of ErshiwuweiShanhuwan.

ErshiwuweiShanhuwan;Aristolochic Acids;Heavy Metal;Mercury salts

10.16249/j.cnki.54-1034/c.2015.02.011

R291.4

A

1005-5738(2015)02-065-06

[責任編輯：張建偉]

2015-06-12

劉鳳玲，女，漢族，山東單縣人，菏澤家政職業(yè)學院高級講師，主要研究方向為分析化學。