郭小芳 姚文娟 桑丁次措 鄧茵 普布古吉 德吉

（西藏大學理學院 西藏拉薩850000）

西藏拉薩市城關區(qū)市售水果酵母菌的分離與鑒定

郭小芳 姚文娟 桑丁次措 鄧茵 普布古吉 德吉

（西藏大學理學院 西藏拉薩850000）

開展酵母菌多樣性研究，能夠為酵母菌資源的開發(fā)與利用奠定基礎。2015年4～7月，在拉薩市城關區(qū)水果市場購買12種水果，用搗碎法從水果表面及果肉分離酵母菌，結合經典分類法及26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析，對酵母菌菌株進行系統(tǒng)分類。酵母菌多樣性指數的計算采用EXCEL數據處理軟件按對應公式進行，采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析不同水果酵母菌總豐度差異。結果顯示：分離自拉薩市城關區(qū)12種市售水果的239株酵母菌歸為隱球酵母屬Cryptococcus、紅酵母屬Rhodotorula、德巴利酵母屬Debaryomyces、有孢漢遜酵母屬Hanseniaspora和鎖擲酵母屬Sporidiobolus等5個屬10個種，其中淺黃隱球酵母Cryptococcusflavescens為優(yōu)勢種，其在供試水果中出現頻率為100%，相對豐度約47%；不同水果酵母菌物種豐富度表明，杏和西瓜中酵母菌種類最多，其次為葡萄，檸檬和芒果則僅分離到一種；酵母菌總豐度差異性分析顯示，哈密瓜中酵母菌數量最多，蘋果中則最少；Shannon-W iener多樣性指數（H′）、Pielou均勻度指數(J′)及Simpson多樣性指數（D）顯示，杏、梨和葡萄中酵母菌多樣性最豐富，檸檬和芒果中最少。研究顯示供試水果酵母菌群落間存在一定差異。

拉薩；水果；酵母菌；多樣性；26SrDNA D1/D2

受多種因素的影響，采后水果極易腐爛變質，導致巨大損失，其中侵染性病害是引起新鮮水果腐爛變質的主要原因[1]?？刂扑珊蟛『ψ畛Ｓ玫姆椒ㄊ腔瘜W殺菌劑，但隨著人們環(huán)保意識的增強和對食品安全的持續(xù)關注，利用拮抗微生物替代傳統(tǒng)化學殺菌劑控制水果采后病害已成為研究熱點[2]。拮抗細菌、放線菌等在內的很多微生物盡管具有較強的生防潛力，但安全性卻令人擔憂。酵母菌由于廣泛分布于自然生態(tài)系統(tǒng)，且人類幾乎每天會隨食物攝取大量活酵母菌，卻很少引起不適，因此拮抗酵母菌因不產生有害代謝產物、遺傳穩(wěn)定、抑菌譜廣、適應能力強且生長迅速等特點，在控制水果貯藏期病害方面顯示

出巨大的潛力和廣闊的應用前景[3]。目前，對于拮抗酵母菌的研究存在研究地區(qū)不廣泛等現象，而且一些酵母菌存在對環(huán)境適應能力差等現象，極大地限制了具有優(yōu)良生防活性的酵母菌的篩選與應用。

青藏高原是世界上海拔最高的生態(tài)系統(tǒng)，高寒、缺氧、輻射強等因素相互作用形成了青藏高原獨特的自然地理環(huán)境，同時孕育了豐富且特殊的微生物資源[4]。本研究旨在開展拉薩市城關區(qū)市售水果酵母菌多樣性研究，為青藏高原酵母菌資源的開發(fā)利用提供依據，并為產胞外酶及具有生物防治效果的活性酵母菌的篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水果

2015年4～7月，在拉薩市城關區(qū)水果市場購買12種水果，包括蘋果、梨、柑橘、香蕉、檸檬、番茄、哈密瓜、芒果、桃、葡萄、杏和西瓜。

1.1.2 培養(yǎng)基

酸化YPD培養(yǎng)基和酸化PDA培養(yǎng)基，具體配制參考嚴亞萍等[5]的方法進行。

1.2 酵母菌的分離純化

用無菌小刀取水果果皮和果肉各10g，搗碎后分別置于盛有100ml無菌水的三角瓶中，振蕩10min，分別接種0.2ml果汁懸液于酸化YPD培養(yǎng)基和酸化PDA培養(yǎng)基上，涂勻，每個處理重復3次。室溫培養(yǎng)3-4d后，進行酵母菌菌落計數 ，并挑取菌落接種于YPD斜面。酵母菌菌株的純化采用平板劃線法。

1.3 酵母菌的分類鑒定

分離獲得的酵母菌采用經典分類法[6]進行形態(tài)學觀察，并結合26SrDNA D1/D2區(qū)域序列分析進行分類鑒定。

1.3.1 基因組DNA的提取：參照Kurtzman etal[7]方法提取。

1.3.2 PCR擴增與測序：26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的PCR擴增和測序參照Nisiotou etal[8]的方法。用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴增所分離菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域。PCR擴增程序為：94℃、5min，94℃、1min，56℃、1min,72℃、1.5min，共進行35個循環(huán)；72℃、10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。所得產物送上海生物工程有限公司進行測序。

1.3.3 序列分析：供試菌株26S rDNA D1/D2測序結果采用DNAStar軟件進行圖譜分析，對序列進行人工校對，校正后的序列在GenBank核酸序列數據庫(Nucleotide)中進行同源性搜索(BLAST search)，選取與供試菌株關系較近的模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列比較其相似程度[9]。

1.4 數據處理

Shannon-Wiener多樣性指數(H′)、Pielou均勻度指數(J′)及Simpson多樣性指數(D)等酵母菌多樣性指數采用EXCEL軟件進行計算；不同水果酵母菌總豐度差異性分析采用SPSS 19.0的Duncan檢驗法；計算不同水果間酵母菌Jaccard相似性系數。酵母菌多樣性指數主要包括物種豐富度、酵母菌總豐度、出現頻率、相對豐度、Shannon-Wiener多樣性指數(H′)、Pielou均勻度指數(J′)及Simpson多樣性指數(D)等。

其中：物種豐富度指從某一水果分離的酵母菌物種數；酵母菌總豐度指某一水果分離的酵母菌數量，即每克水果中分離到的酵母菌菌落數，用cfu/g表示；出現頻率為某一種酵母菌出現的水果種數占所有水果種類的百分比；相對豐度指某一種酵母菌菌株數占所有酵母菌菌株數的百分比。即

N為從某一水果表面及果肉中分離的酵母菌總株數；Pi為某一水果第i種酵母菌菌株數與該水果酵母菌總株數的比值。

Jaccard相似性系數為兩種水果共有的物種數與兩種水果酵母菌物種數并集的比值。

2 結果分析

2.1 拉薩市城關區(qū)市售水果酵母菌群落組成分析

表1 拉薩市城關區(qū)市售水果酵母菌種群分布

結合經典分類法及26SrDNA D1/D2區(qū)域序列分析法將分離自拉薩市城關區(qū)12種市售水果表面及果肉的239株酵母菌歸為5個屬10個種。結果顯示（見表1），其中的21株屬于子囊菌酵母（2個屬2個種），占分離菌株數的8.78%；218株為擔子菌酵母（3個屬8個種），占91.2%?？梢钥闯觯?2種水果中擔子菌酵母菌占明顯優(yōu)勢。

表1數據表明，獲得的隱球酵母屬Cryptococcus種類最多，為4個種，其次為紅酵母屬Rhodotorula為3個種，鎖擲孢酵母屬Sporidiobolus、有孢漢遜酵母屬Hanseniaspora和德巴利酵母屬Debaryomyces均為1個種。

分析10種酵母菌在供試水果中的分布情況，可以看出（見表1），淺黃隱球酵母Cryptococcus flavescens出現頻率最高，為100%，其次為粘紅酵母Rhodotorula glutinis（58.3%），Cryptococcus adeliensis、葡萄有孢漢遜酵母Hanseniaspora uvarum和禾本紅酵母Rhodotorula graminis在12種水果中的分布也較廣，出現頻率均大于30%。相對而言，Cryptococcus victoriae分布不太廣泛，主要存在于蘋果和香蕉。Sporidiobolus pararoseus和膠紅酵母Rhodotorulamucilaginosa兩種酵母菌出現頻率最低，前者僅從杏中分離到，后者則僅存在于西瓜中。

酵母菌屬水平相對豐度數據顯示（見表1），隱球酵母屬Cryptococcus相對豐度最高，為66.15%，其次

為紅酵母屬Rhodotorula為24.69%，鎖擲孢酵母屬Sporidiobolus和有孢漢遜酵母屬Hanseniaspora相對豐度最低且均為0.42%。由此可看出，隱球酵母屬Cryptococcus和紅酵母屬Rhodotorula是拉薩市城關區(qū)市售常見水果酵母菌的優(yōu)勢屬。

分析酵母菌種水平總相對豐度，可以看出，淺黃隱球酵母C.flavescens相對豐度最高，為46.9%，其次為粘紅酵母Rh.glutinis（15.9%），C.Carnescens、禾本紅酵母Rh.Graminis、C.adeliensis及葡萄有孢漢遜酵母H.uvarum相對豐度也較高，約為8%。膠紅酵母Rh，mucilaginosa和S.pararoseus均分離到1株，相對豐度僅為0.42%。酵母菌出現頻率和總相對豐度數據表明，淺黃隱球酵母C.flavescens為供試12種水果酵母菌優(yōu)勢種。

另外，比較12種水果酵母菌群落組成情況，可以看出，淺黃隱球酵母C.flavescens是香蕉、檸檬、番茄、哈密瓜、芒果、桃、杏及西瓜等8種水果的主要酵母菌。除淺黃隱球酵母C.flavescens之外，禾本紅酵母Rh. graminis在杏中分布數量也較多。葡萄有孢漢遜酵母H.uvarum和禾本紅酵母Rh.graminis是葡萄的主要酵母菌。蘋果的優(yōu)勢酵母菌則為C.carnescens，而梨和柑橘中分布的酵母菌主要為粘紅酵母Rh.glutinis。2.2拉薩市城關區(qū)市售水果酵母菌組成相似度分析

表2 拉薩市城關區(qū)市售水果酵母菌Jaccard相似性系數

為比較供試的不同水果酵母菌物種組成的相似性，計算了水果間酵母菌物種Jaccard相似性系數。從表2可以看出，12種水果酵母菌Jaccard相似度系數介于0.14和1之間。芒果和檸檬、番茄和哈密瓜的酵母菌物種相似度最高，相似性系數為1，而杏和番茄、杏和哈密瓜的相似度最低，僅為0.14。除此以外，芒果和檸檬與杏和西瓜的相似度也較低，系數僅為0.17。總之，除一些水果間酵母菌群落組成相似外，供試的大多數水果間酵母菌組成存在不同程度的差異。

2.3 拉薩市城關區(qū)市售水果酵母菌多樣性指數分析

表3數據顯示，杏和西瓜酵母菌物種豐富度最高，從中均分離到6種酵母菌，其次是葡萄（5種），而檸檬和芒果中僅分離到1種酵母菌，分布的酵母菌種類最少。

酵母菌總豐度顯示（見表3），哈密瓜中分布的酵母菌數量明顯高于其他水果，為6.01×104cfu/g；蘋果酵母菌總豐度相對最低，雖與柑橘、芒果等5種水果無顯著差異（P＞0.05），但是明顯低于其他6種水果的酵母菌總豐度（P＜0.05），僅為8×102cfu/g。

Shannon-Wiener多樣性指數（H′）、Pielou均勻度指數(J′)及Simpson多樣性指數（D）顯示（見表3），杏、梨和葡萄中酵母菌多樣性最豐富，分布也相對均勻，其中杏和梨的H′和D約為1.16和0.67；柑橘和桃的酵母菌多樣性也較豐富，而檸檬和芒果的多樣性指數最低。

表3 拉薩市城關區(qū)市售水果酵母菌多樣性指數

3 討論

為初步探討青藏高原氣候條件對水果酵母菌群落結構的影響，擬就內地水果與本研究供試對應水果酵母菌種類進行比較。來自蘭州水果市場的紅富士和煙臺安德利果汁有限公司果汁生產線蘋果中的酵母菌主要包括假絲酵母屬Candida、克勒克酵母屬Kloeckera、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae、出芽短梗霉Aureobasidium pullulans及皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum等[10-11]，而本研究從蘋果中獲得的酵母菌則為隱球酵母屬Cryptococcus的三種酵母和粘紅酵母Rh.glutinis。分離自芒果的酵母菌為尼泊爾德巴利酵母D.nepalensis、Hanseniaspora opuntiae和異常威克漢姆酵母Wickerhamomyces anomalus[12-13]，而本研究從芒果中分離到的酵母菌為淺黃隱球酵母C.flavescens。研究表明[14]，分離自四川自貢市場柑橘的酵母菌主要包括Candida quercitrusa、蜜二糖假絲酵母C.melibiosica、畢赤酵母屬Pichia以及異常威克漢姆酵母W.anomalus，雖然從柑橘中也分離到4種酵母菌，但種類完全不同于文獻顯示的種類。另外，哈密瓜酵母菌主要為釀酒酵母S.cerevisiae和高里畢赤酵母p.guilliermondii[15]，本研究分離的酵母菌則是兩種隱球酵母Cryptococcus。由于酵母菌在葡萄酒釀制中的重要作用，因此葡萄酵母菌種群分布研究很受注。研究表明，不同品種葡萄的酵母菌群落結構存在一定差異，霞多麗葡萄酵母菌主要為釀酒酵母S. cerevisiae、葡萄有孢漢遜酵母H.uvarum、淺黃隱球酵母C.flavescens、發(fā)酵畢赤酵母P.fermentans、拜耳接合酵母Z.bailiii、東方伊薩酵母I.orientalis及Candida zemplinina[16]，而西拉葡萄酵母菌則主要為葡萄有孢漢遜酵母H.uvarum、淺黃隱球酵母C.flavescens、淺白隱球酵母C.albidus、發(fā)酵畢赤酵母P.fermentans、發(fā)酵

接合酵母Z.fermentati及C.zemplinina[17]。宋育陽等[18]從神索葡萄中分離到葡萄有孢漢遜酵母H.uvarum、克魯維畢赤酵母P.kluyveri、C.zemplinina、釀酒酵母S.cerevisiae、巴氏酵母S.pastorianus等酵母菌。孫悅等[19]的研究結果則顯示，梅鹿轍葡萄則以釀酒酵母S.cerevisiae、東方伊薩酵母I.orientalis、克魯維畢赤酵母P.kluyveri為主，這與本研究供試葡萄酵母菌群落組成有一定差異。綜上所述，拉薩水果與內地對應水果的酵母菌群落組成存在顯著差異，其原因一方面源于水果品種及微生物分離及培養(yǎng)條件等，也可能由于貯藏期環(huán)境條件對酵母菌種群結構產生了一定影響，進而導致分離的酵母菌間存在顯著差異。

供試水果中，除西瓜為西藏林芝產以外，其他均來自于內地。來源于內地的水果不同于整個生長期均處于青藏高原的當地產水果，其中酵母菌可能主要為生長期附生的酵母菌，其群落結構與拉薩地區(qū)的氣候等也許沒有明顯相關性。盡管如此，開展市售水果酵母菌多樣性研究的重要性仍是不容置疑的，一方面，運達拉薩后水果所處環(huán)境會在一定程度上影響其表面酵母菌群落組成，低氧或寒冷環(huán)境也許能夠促進某些與此環(huán)境相適應的具有特殊功能的酵母菌的生長或繁殖能力，從而易于分離，進而有利于具有特殊應用價值的酵母菌的開發(fā)。另外，本研究能夠為拉薩乃至青藏高原不同生境或植物表面酵母菌多樣性或資源的保護利用奠定基礎。

4 結論

采用搗碎法從拉薩市城關區(qū)市售的12種水果中共獲得239株酵母菌。結合經典分類和26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析法，將這些酵母菌歸為5個屬10個種。5個屬中隱球酵母屬Cryptococcus相對豐度最高，超過66%，其中淺黃隱球酵母C.flavescens在所有水果中均有分布，相對豐度約為47%，為供試水果的優(yōu)勢種酵母，而膠紅酵母Rh.mucilaginosa和S.pararoseus數量最少，僅分離到1株。酵母菌多樣性指數顯示，杏、梨和葡萄中酵母菌多樣性最豐富，而檸檬和芒果中酵母菌種類極少且分布不均勻。

[1]周雅涵,羅楊,曾凱芳.拮抗酵母菌對果蔬采后病害生防增效途徑及機理研究進展[J].食品科學,2011,32(17):362-365.

[2]林曉敏,譚曉榮.拮抗酵母菌防治果蔬采后病害的研究[J].北方園藝,2015(1):182-186.

[3]戴瑩,王紀華,韓平,等.拮抗酵母菌復合保鮮技術在果蔬保鮮中的應用研究進展[J].食品安全質量檢測學報,2015,(3):742-745.

[4]孔維棟.極地陸域微生物多樣性研究進展生物多樣性[J].生物多樣性,2013,21(4):456-467.

[5]嚴亞萍,李治瀅,董明華,等.云南陽宗海酵母菌種群結構及產胞外酶測試[J].微生物學報,2013,53(11):1205-1212.

[6]Kurtzman CP,Fell JW,Boekhout T.The Yeast:A Taxonom ic Study(5th eds)[M].Elsevier Science,2011.

[7]Kurtzman CP，Robnett CJ.Identification and phylogeny ofascomycetousyeasts from analysisofnuclear large subunit(26S)ri?bosomalDNA partialsequences[J].Antonie van Leeuwenhoek,1998,73:331-371.

[8]N isiotou AA,Spiropoulos AE,Nychas G-JE.Yeast community structures and dynam ics in healthy and Botrytis-affected grapemust fermentations[J].Applied and EnvironmentalM icrobiology,2007,73(21):6705-6713.

[9]白逢彥,王辰.海南熱帶雨林腐木上酵母菌物種多樣性研究[J].菌物學報,2009，28(3):354-362.

[10]陳曉前,趙萍,王家利,等.貯藏蘋果中酵母菌的分離、初步鑒定及其抑制研究[J].中國釀造,2009(10):51-52.

[11]王麗敏，李軍,胡小松.蘋果原料中酵母菌的分離鑒定[J].中國農業(yè)大學學報,2004,9(4):14-17.

[12]岑濤,岳田利,袁亞宏,等.云南芒果中酵母分離鑒定及芒果酒發(fā)酵應用[J].食品科學,2014.

[13]羅姍姍,王潤菡,萬斌,等.具有拮抗膠孢炭疽菌活性酵母菌的分離和篩選[J].食品工業(yè)科技,2015,36(14),216-219.

[14]劉陽,鄧靜,吳華昌,等.柑橘果皮中生香酵母的篩選及揮發(fā)性香氣成分分析[J].食品安全質量檢測學報,2014,5(12):4050-4055.

[15]李曉華.3株哈密瓜酒酵母的分子生物學鑒定[J].中國釀造,2013,32(2):73-76.

[16]李雙石,李浡,晉中美,等.霞多麗葡萄自然發(fā)酵過程中酵母種群的分布與變化規(guī)律[J].食品科技,2012,37(9):6-9.

[17]李雙石,蘇寧,劉芯蕊,等.西拉葡萄相關酵母菌群的分布研究食品研究與開發(fā)[J].食品研究與開發(fā),2011,32(9):186-189.

[18]宋育陽,白穩(wěn)紅,劉延琳.神索葡萄自然發(fā)酵酵母菌群研究[J].華中農業(yè)大學學報,2010,29(4):513-517.

[19]孫悅,宋育陽,劉延琳.梅鹿輒葡萄自然發(fā)酵酵母菌群研究[J].中國釀造,2011(9):27-29.

Isolation and Identification of Yeasts from Commercial fruits in Chengguan District in Lhasa

Guo Xiao-fang YaoWen-juan Sangding-Cicuo Deng-yin Pubu-Guji De-ji
(Schoolof Science,TibetUniversity,Lhasa 850000,China)

The research on the diversity of yeasts has been the foundation for the exploitation and utilization of yeast resources.Yeasts isolated from fruits surfacewere identified by 26S rDNA D1/D2 domain sequence analy?sis.Yeast diversity indices were calculated and the total abundance of yeast between different fruits was com?pared by Spass statistics 19.0.The results showed that 239 yeast isolates obtained from 12 kinds of fruitswere identified and belonging to 5 genera(Cryptococcus、Rhodotorula、Debaryomyces、Hanseniaspora and Sporid?iobolus)and 10 species,in which Cryptococcusflavescens was dominantspecieswith 100%ofoccurring frequen?cy and 47%of relative abundance;the highest species richness of yeasts found in apricot and watermelon fol?lowed by grape.However,only one strain found in lemon andmango.The analysis of yeast total abundance dis?played that themaximum number of yeast found in Hamimelon,the highest yeast diversity found in apricot, pearand grapeand the lessdiversity found in lemon andmango.The study showed thatdifferentyeasts communi?ty existed in various fruits.

Lhasa;fruit;yeast;diversity;26S rDNAD1/D2

10.16249/j.cnki.54-1034/c.2015.02.004

Q949.32

A

1005-5738(2015)02-021-07

[責任編輯：索郎桑姆]

2015-09-08

2014年度西藏自治區(qū)大學生創(chuàng)新實驗訓練計劃項目“拉薩城關區(qū)市售水果中的酵母菌的生物防治效果初探”階段性成果，項目號：2014QCX016

郭小芳，女，漢族，甘肅蘭州人，西藏大學理學院副教授，主要研究方向為微生物生態(tài)學。