梁莉莉，陳 劍，侯敬麗，張 莉

（1．上海交通大學分析測試中心，上海 200240；2．上海交通大學藥學院，上海 200240）

元素分析－穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)在嬰幼兒配方奶粉奶源地追溯中的應(yīng)用

梁莉莉1，陳 劍2，侯敬麗1，張 莉1

（1．上海交通大學分析測試中心，上海 200240；2．上海交通大學藥學院，上海 200240）

嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒的主要食品，為加強其品質(zhì)監(jiān)管，建立了元素分析－穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（EAIRMS）同時測定嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白δ15N和δ13C值的方法。通過優(yōu)化的等電點沉淀法可以從嬰幼兒配方奶粉中獲得高純度的蛋白（純度大于96％）。利用納升液相－四極桿飛行時間質(zhì)譜對提取的蛋白進行定性分析，確認其為酪蛋白。利用EA－IRMS測定分離得到的酪蛋白δ15N和δ13C值發(fā)現(xiàn)，δ15N和δ13C與奶源產(chǎn)地有一定的相關(guān)性，同一產(chǎn)地的嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值分布范圍一致，而不同奶源產(chǎn)地的則存在差異。該方法前處理簡單、重現(xiàn)性好、測試方便、準確度高，可以用來追溯國內(nèi)市場上嬰幼兒配方奶粉的奶源產(chǎn)地。

嬰幼兒配方奶粉；元素分析－穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（EA－IRMS）；奶源產(chǎn)地

嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒的主要食品［1］，近年來，國內(nèi)奶粉市場以假充真、以次充好的現(xiàn)象不斷發(fā)生，這直接影響了嬰幼兒的食品安全［2］。嬰兒配方奶粉原料奶的質(zhì)量是其質(zhì)量安全的基礎(chǔ)［3］，因此，追溯奶粉原料奶的產(chǎn)地加強原料奶產(chǎn)地的監(jiān)督檢查至關(guān)重要。

目前，奶粉的檢測方法有凱氏定氮法、高效液相色譜法、近紅外光譜法、傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）［4］、紫外分光光度法［5］、氨基酸分析檢測法［6］等。GB／T 5009．5—2003中介紹了凱氏定氮法、分光光度法和燃燒法3種蛋白質(zhì)的檢測方法［7］。此外，李宏梁等［8］采用等電點滴定法分離市售乳制品中的酪蛋白，并通過檢測酪蛋白的含量來鑒定市售乳制品是否摻假。這些方法僅測定了奶粉中蛋白質(zhì)的含量，卻無法對奶粉的來源產(chǎn)地進行示蹤。因此，探索可以追溯奶粉來源產(chǎn)地的方法非常必要。

穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（IRMS）技術(shù)是一種研究產(chǎn)地溯源的有效方法，國外在2001年已有相關(guān)報道［9］。近年來，IRMS技術(shù)在我國食品研究領(lǐng)域的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注［10］，已被用于果汁真?zhèn)舞b別及產(chǎn)地溯源［11］、葡萄酒原產(chǎn)地鑒定［12］、海洛因來源鑒定［13］以及牛肉產(chǎn)地溯源［14］等研究。Scampicchio等［15］通過IRMS技術(shù)開展了牛奶的產(chǎn)地鑒別研究。李鑫等［16］報道了IRMS技術(shù)用于原料乳粉的檢驗，發(fā)現(xiàn)對于來源各異的原料乳粉（含半成品原料、牛初乳粉），均有各自穩(wěn)定且差異性顯著的δ13C區(qū)間；同時提出，在半成品的原料乳粉中測得的δ13C值，在配方奶粉1段～3段呈現(xiàn)出規(guī)律變大的趨勢，推測是由于外源添加物和生產(chǎn)工藝的不同，對δ15N和δ13C值的精確測定產(chǎn)生了影響。

由于配方奶粉中其他非原料奶成分的干擾，數(shù)據(jù)偏差較大、數(shù)據(jù)分布分散、無明顯的規(guī)律可循。因此，在嬰兒配方奶粉直接檢測時，找到一種能夠排除外來添加物干擾，真實反映奶粉特征的物質(zhì)非常重要。酪蛋白作為奶粉蛋白質(zhì)的主要成分［17］，經(jīng)分離提純后，利用元素分析－穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（EA－IRMS）技術(shù)檢測時，其他因素影響降低，檢測數(shù)據(jù)更為精確。因此，可以通過分離純化的方式提取配方奶粉中的酪蛋白，測定其δ15N和δ13C值來追溯配方奶粉來源產(chǎn)地。因為飼料與碳同位素組成密切相關(guān)［18］，而氮同位素組成不但與飼料種類有關(guān)，也與氣候、土壤及施肥等因素有關(guān)［19］，地域之間樣品的δ15N值有可能相互重疊。因此，不同產(chǎn)地奶牛的喂養(yǎng)方式的不同，可能導致奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值存在差異，將兩者共同比較可以進行奶源產(chǎn)地一致性的判別，以提高產(chǎn)地來源判別的準確率［20］。

本工作擬建立一種簡單、快速的分離提純嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的方法，利用EAIRMS法對獲得的酪蛋白進行測定，得到相應(yīng)的δ15N和δ13C值，通過比較不同產(chǎn)地嬰兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值，來判斷配方奶粉奶源產(chǎn)地與標注產(chǎn)地是否一致。

1 實驗部分

1．1 主要儀器與裝置

Vario ELⅢ－Isoprime元素分析－穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀：德國Elementar公司產(chǎn)品，配有高溫燃燒爐、吸附－解吸附裝置、高靈敏度熱導檢測器（TCD）和Isoprime檢測裝置；M5X百萬分之一克電子天平：瑞士梅特勒－托利多公司產(chǎn)品；UltiMate3000RSL納升液相色譜儀：美國Thermo－Fisher公司產(chǎn)品；Maxis impact UHR四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀：德國Bruker Daltonics公司產(chǎn)品；Milli－Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；高速離心機：德國Hermle公司產(chǎn)品。

1．2 主要材料與試劑

氧化管填充三氧化鎢，還原管填充高純線狀銅及銀棉：均為艾利蒙塔貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；高純He（濃度≥99．999％）：上海四季氣體設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高純O2、高純N2（濃度≥99．999％）：上海五鋼氣體有限責任公司產(chǎn)品；高純CO2（濃度≥99．995％）：上海成功氣體工業(yè)有限公司產(chǎn)品；酪蛋白標準品：英國Elemental Microanalysis公司產(chǎn)品；C18反相分析柱（75μm×15cm×3μm）：美國Thermo－Fisher公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇、碘乙酰胺：美國

Sigma公司產(chǎn)品；Trypsin（Promega測序級）：美國Promega公司產(chǎn)品；無水乙腈（色譜純）：德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸（色譜純）：德國CNW公司產(chǎn)品；無水乙醇（分析純）、無水乙醚（分析純）、無水乙酸（優(yōu)級純）、無水乙酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

實驗用嬰幼兒奶粉：購自荷蘭當?shù)氐?段（0～6個月嬰兒適用）、2段（6～12個月嬰幼兒適用）、3段（1～3歲幼兒適用）嬰幼兒配方奶粉及在國內(nèi)市場購得的同品牌荷蘭原裝進口的1段（0～6個月嬰兒適用）、2段（6～10個月嬰幼兒適用）、3段（10個月以上嬰幼兒適用）嬰幼兒配方奶粉，每種奶粉分2～8個批次；國內(nèi)市場購買的適合1歲嬰幼兒食用的新西蘭、荷蘭、愛爾蘭原裝進口配方奶粉，每種奶粉分2個批次。

1．3 實驗條件

1．3．1 元素分析儀條件 氧化管填充三氧化鎢，溫度1 150℃；還原管填充線狀銅及銀棉，溫度810℃，加氧時間90s。

1．3．2 穩(wěn)定同位素質(zhì)譜條件 電子轟擊離子化源（EI），連續(xù)流進樣系統(tǒng)，以酪蛋白作為標準品（δ13CV－PDB＝（－26．98±0．13）‰，δ15NAIR＝（5．94±0．08）‰）對參比氣CO2、N2進行校準。碳氮穩(wěn)定同位素比值以國際通用的δ值表示。

1．3．3 納升液相色譜－四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀條件 ESI＋模式；多肽C18反相分析柱（75μm×15cm×3μm）；流動相：含有0．1％甲酸的水（A）和乙腈（B）；洗脫梯度：5％～35％B、27min，35％～90％B、2min，90％B、15min；流速400mL／min。

1．4 樣品前處理方法

1．4．1 提取酪蛋白 將1g奶粉在攪拌中溶于40℃，pH 4．7的15mL醋酸－醋酸鈉緩沖溶液中，靜置，在4℃下，以3 000r／min離心15min，傾倒上清液，依次用水、95％乙醇、乙醇－無水乙醚混合溶液（1∶1，V／V）和無水乙醚洗滌沉淀，抽濾，晾干，于50℃烘箱中干燥30min，得到待測的酪蛋白樣品。

1．4．2 鑒定酪蛋白 稱取2mg酪蛋白，用25mmol／L NH4HCO3溶液溶解。取50μg酪蛋白樣品，經(jīng)二硫蘇糖醇還原和碘乙酰胺烷基化處理后，加入2μg Trypsin酶解16h，利用ZipTip微量層析柱脫鹽處理，樣品干燥保存。上機測試時，在多肽樣品中加入35μL上樣緩沖液（98％水，2％乙腈和0．1％甲酸混合液），溶解測試。

2 結(jié)果與討論

2．1 酪蛋白提取方法的優(yōu)化

方法1：參考國際乳業(yè)聯(lián)盟（IDF）方法［15］進行奶粉中酪蛋白的提取，雖然該方法用于提取牛奶中酪蛋白的效果很好，但是用于配方奶粉中酪蛋白提取時的純度很低，僅為54．58％。

方法2：參考張乃武等［21］報道的用乙酸調(diào)節(jié)pH值、過濾分離等方法提取奶粉中酪蛋白，該方法簡便易行，純度較方法1有所提高，為79．58％，但仍不夠理想。

方法3：按1．4．1節(jié)方法提取奶粉中酪蛋白，操作簡單、無特殊條件要求，而且提取的酪蛋白純度很高，以實驗檢測所用的標準品酪蛋白的氮百分含量（N％）作為參照，經(jīng)元素分析儀檢測，該方法分離提取的酪蛋白純度可達到99．7％。

2．2 提取的酪蛋白樣品的鑒定

利用納升液相色譜－四極桿飛行時間質(zhì)譜對方法3所提取的酪蛋白樣品進行定性分析。通過酶解處理，LC－MS／MS測定，利用Mascot 2．4搜庫軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫為Bostaurus（5 983個條目），固定修飾設(shè)為Carbamidomethyl（C），可變修飾設(shè)為oxidation（M），容許漏切位點數(shù)為2，一級MS質(zhì)量精度為2×10－5，二級MS質(zhì)量精度為0．05。鑒定到的蛋白為Alpha－S1－casein，即Alpha－S1酪蛋白，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，質(zhì)譜檢測到該蛋白分子質(zhì)量為24．5ku，檢測到不同肽段數(shù)為5（大于2），mascot打分為1 359．5分（高于50），氨基酸覆蓋率達45．8％，所以該蛋白被鑒定為酪蛋白。

2．3 EA－IRMS技術(shù)檢測同一種嬰幼兒奶粉中酪蛋白

選取6個不同批號的荷蘭原裝進口2段嬰幼兒配方奶粉作為樣品，按2．1中方法3提取其酪蛋白并進行檢測，結(jié)果列于表1。

表1 樣品1～6中酪蛋白的δ15N和δ13C值Table 1 δ15N andδ13C of casein in sample 1－6

由表1可知，按照方法3分離提取嬰幼兒配方奶粉樣品1～6中的酪蛋白，并用EAIRMS方法進行檢測，以標準品酪蛋白的N％作為參照，提取得到的酪蛋白純度在96．25％～99．70％之間。不同樣品的δ15N值在5．80‰～6．35‰之間，偏差范圍在－0．23‰～0．32‰之間；δ13C值在－22．14‰～－21．26‰之間，偏差范圍在－0．48‰～0．40‰之間。多次實驗結(jié)果說明，該方法的重現(xiàn)性好，能夠保證待測樣品檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性。

2．4 EA－IRMS技術(shù)檢測同品牌不同年齡段食用的嬰幼兒奶粉中酪蛋白

以荷蘭某品牌嬰幼兒配方奶粉為研究對象，分別在荷蘭當?shù)刭徺I該品牌1段、2段、3段嬰幼兒配方奶粉，并在國內(nèi)購買該品牌原裝進口1段、2段、3段嬰幼兒配方奶粉，每種奶粉購買2個不同批號。用優(yōu)化的方法提取酪蛋白，利用EA－IRMS測定所獲得的酪蛋白的δ15N和δ13C值，進一步確定該方法的可行性，結(jié)果列于表2。

表2 同品牌荷蘭當?shù)嘏c國內(nèi)原裝進口嬰兒配方奶粉酪蛋白δ15N和δ13C值對照表Table 2 δ15N andδ13C of casein in Netherlands and domestic imported milk powder

由表2所可見，所測酪蛋白的δ15N值在5．74‰～6．36‰之間，偏差范圍在0．38‰以內(nèi)；δ13C值在－22．18‰～－21．08‰之間，偏差范圍則保持在0．66‰以內(nèi)。說明同一來源產(chǎn)地的配方奶粉中，酪蛋白δ15N和δ13C值的分布范圍保持一致。這說明，用優(yōu)化后的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液處理配方奶粉，分離提純其中的酪蛋白，并采用EA－IRMS技術(shù)檢測所得到酪蛋白中的δ15N和δ13C值，來判別嬰幼兒配方奶粉奶源地一致性的研究方法具有可行性。

2．5 EA－IRMS技術(shù)檢測不同品牌嬰幼兒奶粉中酪蛋白

收集國內(nèi)市場上適合1歲嬰幼兒食用的新西蘭、愛爾蘭、荷蘭3個國家不同批次的原裝進口嬰幼兒配方奶粉，提取其中的酪蛋白，利用EA－IRMS技術(shù)檢測酪蛋白的δ15N和δ13C值，結(jié)果列于表3。

表3 國內(nèi)市場上原裝進口嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值對照表Table 3 δ15N andδ13C of casein in domestic imported milk powder

由表3可知，同一產(chǎn)地不同批次嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值較接近，而不同奶源產(chǎn)地嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值明顯不同。新西蘭與荷蘭奶粉中酪蛋白的δ15N差異性較小，但δ13C值區(qū)別較大，而新西蘭與愛爾蘭奶粉中酪蛋白的δ15N差異性較大，但δ13C值區(qū)別較小，所以同時測定δ15N和δ13C值，將兩者共同比較，可以進行奶源產(chǎn)地一致性的判別。

本實驗進一步對國內(nèi)市場上同一品牌愛爾蘭原裝進口的多個嬰幼兒配方奶粉樣品進行檢測。結(jié)果表明，某一批號奶粉雖然從外觀上未發(fā)現(xiàn)與同品牌不同批號奶粉有何差別，但其酪蛋白的δ15N和δ13C值卻差別較大，結(jié)果列于表4。

表4 國內(nèi)市場上愛爾蘭原裝進口嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值對照表Table 4 δ15N andδ13C of casein in Ireland imported milk powder

由表4可知，同一品牌的愛爾蘭原裝進口嬰幼兒配方奶粉，樣品3的δ15N和δ13C值與樣品1、2的δ15N和δ13C值差異較大，說明樣品3的奶源產(chǎn)地與標注產(chǎn)地存在不一致性。不同產(chǎn)地奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值主要取決于奶牛的飼料組成，而不同產(chǎn)地的奶牛喂養(yǎng)方式不同有可能導致奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值存在差異，所以該奶粉有可能為虛假產(chǎn)地奶粉。

3 結(jié)論

本實驗利用元素分析－穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)對同一奶源產(chǎn)地以及不同奶源產(chǎn)地嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值進行測定。通過優(yōu)化奶粉中酪蛋白的提取方法，可以獲得高純度的酪蛋白樣品。研究發(fā)現(xiàn)，在國內(nèi)以及荷蘭當?shù)刭徺I的同一品牌荷蘭原裝嬰幼兒配方奶粉，同一奶源產(chǎn)地嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白的δ15N和δ13C值分布范圍保持一致。而對國內(nèi)購買的不同品牌原裝進口奶粉的測定顯示，新西蘭與荷蘭奶粉中酪蛋白的δ15N差異性不大，但δ13C值區(qū)別較大；新西蘭與愛爾蘭奶粉中酪蛋白的δ15N差異性較大，但δ13C值區(qū)別不大，所以同時測定δ15N和δ13C值，并將兩者共同比較，可以進行奶源產(chǎn)地一致性的判別。該方法前處理簡單、重現(xiàn)性好、測試方便、準確度高，可以用來示蹤國內(nèi)市場上嬰幼兒配方奶粉的產(chǎn)地來源。

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Traces of Infant Formula Milk Powders by Elemental Analysis－Stable Isotope Ratio Mass Spectrometry

LIANG Li－li1，CHEN Jian2，HOU Jing－li1，ZHANG Li1
（1．Instrumental Analysis Center，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China；2．School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

In order to strengthen the supervision of the quality of infant formula milk powders which is the main food of infants，δ15N andδ13C of casein in infant formula milk powders were determined by elemental analysis－stable isotope ratio mass spectrometry（EA－IRMS）．Casein which purity was over 96％，was extracted from milk powder by isoelectric precipitation of proteins and identified by nano liquid chromatography ＆quadrupole－time－of－flight mass spectrometer（Nano LC－QTOF－MS）．The ranges ofδ15N and δ13C are correlated with the regional origins of infant formula powders．The values of δ15N andδ13C of casein from the milk powders with the same origin are very similar，whereas they are quite different with different origins．It is a reliable and convenient method to determine the regional origin of infant formula powders．

infant formula powders；elemental analysis－stable isotope ratio mass spectrometry（EA－IRMS）；trace

O 657．63

A

1004－2997（2015）01－0066－06

10．7538／zpxb．youxian．2014．0046

2014－01－20；

2014－04－11

梁莉莉（1990—），女（漢族），河南鄲城人，碩士研究生，高分子化學專業(yè)。E－mail：lily081226＠sjtu．edu．cn

張 莉（1977—），女（漢族），陜西西安人，副研究員，從事轉(zhuǎn)運體介導的前藥研究。E－mail：lizhang09＠sjtu．edu．cn

時間：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0046．html