趙 瑩，薛華麗，畢 陽*，唐亞梅，沈科萍

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

低質(zhì)量濃度T-2處理對馬鈴薯塊莖苯丙烷代謝活性的誘導(dǎo)

趙 瑩，薛華麗，畢 陽*，唐亞梅，沈科萍

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

由鐮刀菌引起的干腐病是導(dǎo)致甘肅省馬鈴薯塊莖貯藏期間的主要病害。以‘隴薯3號(hào)’馬鈴薯為試材，用1 μg/mL T-2處理馬鈴薯塊莖切片，觀察T-2處理對馬鈴薯塊莖切片損傷接種硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）后，其對病斑直徑的抑制效果，以及塊莖切片苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性及產(chǎn)物積累的影響。結(jié)果表明，T-2處理有效降低了塊莖切片損傷接種Fusarium sulphureum的病斑直徑，提高了切片苯丙氨酸解氨酶和4-香豆酰-輔酶A連接酶的活性，促進(jìn)了木質(zhì)素、總酚、類黃酮及花青素的積累。由此表明，低質(zhì)量濃度T-2處理可通過誘導(dǎo)馬鈴薯的苯丙烷代謝增強(qiáng)塊莖對干腐病的抗性。

馬鈴薯；T-2毒素；誘導(dǎo)抗性

馬鈴薯是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，年產(chǎn)量近8 000萬 t，大部分馬鈴薯塊莖采收以后都要經(jīng)過3～6 個(gè)月的貯藏，期間腐爛頗為嚴(yán)重[1-2]，其中由鐮刀菌引起的干腐病是導(dǎo)致塊莖腐爛最重要的病害，西北主產(chǎn)區(qū)的發(fā)病率可達(dá)15%～25%[3]。硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）是導(dǎo)致甘肅省馬鈴薯塊莖干腐病的主要病菌，不僅造成塊莖貯藏期間的經(jīng)濟(jì)損失，而且會(huì)在塊莖體內(nèi)積累對人畜具有潛在危害的單端孢霉烯族毒素[4-7]，其中以3-乙?；?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、4,15-二乙酰氧基-8-異戊酰氧基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-3-醇（epoxytrichothecene，T-2）、蛇形毒素和伏馬菌素最為常見[8]，其中T-2是一種主要由三線鐮刀菌在特定條件下產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，是單端孢霉烯族毒素的重要代表[9]。現(xiàn)已證明，單端孢酶二烯進(jìn)過一系列的加氧、異構(gòu)化、環(huán)化、酯化等復(fù)雜反應(yīng)最終形成T-2[10-11]。一般認(rèn)為，真菌毒素是重要的致病因子[12]，但Nishiuchi等[13]發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度T-2可誘導(dǎo)擬南芥對鐮刀菌的抗性，由此表明，低質(zhì)量濃度T-2具有激發(fā)子的功能。但尚未見低質(zhì)量濃度T-2對馬鈴薯塊莖誘導(dǎo)抗性方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究低質(zhì)量濃度T-2處理對馬鈴薯塊莖切片損傷接種F. sulphureum病斑直徑的影響，及對苯丙烷代謝關(guān)鍵酶及其產(chǎn)物的影響，為完善T-2的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試馬鈴薯塊莖（‘隴薯3號(hào)’）2012年10月采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院一航種業(yè)會(huì)川試驗(yàn)基地。

T-2（分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；H-1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 T-2處理

參照Yin Yan等[14]方法。選取外觀整齊，無明顯病蟲害的馬鈴薯塊莖，先用0.5%的次氯酸鈉表面消毒2 min，無菌水沖洗，過夜晾干，然后用75%的酒精擦洗過的不銹鋼刀將馬鈴薯塊莖切成厚1 cm，直徑3.5 cm的切片，切片先用無菌水清洗，再用75%的酒精擦洗并在酒精燈火焰上灼燒去除多余酒精，后置于已滅菌的濕濾紙上，在黑暗的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中放置4 h，取200 μL的T-2溶液，用滅菌的接種環(huán)均勻涂布于馬鈴薯切片上，以無菌水處理為對照。

1.3.2 T-2處理對馬鈴薯塊莖切片損傷接種F. sulphureum病斑直徑的影響

參照Yin Yan等[14]方法。經(jīng)過T-2處理后，在23～25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)3 d接種病原物。接種方法：取PDA上培養(yǎng)7 d的8 mm的F. sulphureum菌餅，倒置接種于處理后的馬鈴薯切片中央，3 d后用十字交叉法測量病斑直徑，記錄數(shù)據(jù)，每個(gè)處理用8～10 個(gè)切片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 取樣

參照楊志敏等[15]方法。第0、1、2、3、4、5、6、7天取未接種的馬鈴薯塊莖1～3 mm處果肉組織3 g，組織用錫箔紙包好，液氮冷凍，在—80 ℃超低溫冰箱中保存待測。

1.3.4 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性的測定

參照楊志敏等[15]方法。取3.0 g冷凍的馬鈴薯組織，加入5 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L硼酸緩沖液（pH 8.8，含1%交聯(lián)聚維酮、1 mmol/L乙二胺四乙酸和50 mmol/L β-巰基乙醇），冰浴中研磨成勻漿后，在4 ℃、11 250×g離心20 min，上清液用來測定酶的活性。取3 支試管分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，然后向Ⅰ和Ⅱ2 支試管分別加入3 mL 7 mmol/L L-苯丙氨酸溶液（50 mmol/L硼酸緩沖液配制），再分別向Ⅰ和Ⅲ兩只試管中加入500 μL粗酶液后立即于37 ℃保溫1 h，保溫完后立即在290 nm波長處測其OD值，以Ⅱ和Ⅲ混合后測定的OD值為初始值，Ⅰ中測定值為終止值。另以提取液代替酶液按照上述方法測得的OD值分別作為初始值和終止值的對照，以每分鐘OD值變化0.01為1 U，PAL活性表示為U/g。

1.3.5 4-香豆酰-輔酶A連接酶（acid-coenzyme A ligase，4CL）活性測定

參照楊志敏等[15]方法。取3.0 g馬鈴薯組織，加入5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（含25%甘油、0.1 mol/L二硫蘇糖醇、pH 8.0）及少量石英砂，然后于4 ℃、15 000×g離心20 min，收集上清液并立即用于酶活測定。反應(yīng)液包括0.45 mL 15 μmol/L Mg2＋（硫酸鎂或氯化鎂），0.15 mL 5 μmol/mL p-香豆酸，0.15 mL 50 μmol/mL ATP，0.15 mL 1 μmol/mL CoA以及0.5 mL酶液。40 ℃條件下反應(yīng)10 min，在333 nm波長處測定OD值，以每分鐘內(nèi)ΔOD333nm變化0.1為1 個(gè)活性單位（U）。酶活性單位為U/g，對照不加香豆酸。樣品重復(fù)測3 次。

1.3.6 總酚、類黃酮含量的測定

參照曹建康等[16]的方法。取3.0 g馬鈴薯組織，加入5 mL預(yù)冷的1% HCl-甲醇在冰浴條件下充分研磨提取，4 ℃、12 000×g離心10 min。取上清液分別于280 nm和325 nm波長處測定總酚和類黃酮含量。總酚含量表示為ΔOD280nm/g；類黃酮含量表示為ΔOD325nm/g。樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.7 木質(zhì)素含量的測定

參照楊志敏等[15]方法。取3.0 g馬鈴薯組織與預(yù)冷的5 mL 95%乙醇研磨，4 ℃、12 000×g離心10 min，沉淀物用95%乙醇溶液沖洗3 次，再用乙醇-正己烷體積比1∶2沖洗3 次，收集沉淀使其干燥，干燥物溶于1 mL 25%溴化乙酰冰醋酸溶液中，70 ℃恒溫水浴30 min，然后加1 mL 2 mol/L NaOH溶液中止反應(yīng)。再加2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸，離心，取上清液0.02 mL，用冰醋酸定容至5 mL，280 nm波長處測定樣品OD值，木質(zhì)素含量以ΔOD280nm/g表示，樣品重復(fù)測3 次。

1.3.8 花青素含量的測定

參照曹建康等[16]的方法。取3.0 g馬鈴薯組織，加入5 mL預(yù)冷的1% HCl-甲醇在冰浴條件下充分研磨提取，4 ℃避光保存20 min，期間搖動(dòng)數(shù)次，12 000×g離心10 min。取上清液分別于600 nm和530 nm測定花青素含量?；ㄇ嗨睾勘硎緸棣D530nm/g—ΔOD600nm/g。樣品重復(fù)測定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行分析，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差；采用SPPS Statistics 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-2處理對馬鈴薯塊莖切片接種F. sulphureum病斑直徑的影響

圖1 T-2 處理對馬鈴薯塊莖切片接種F. sulphureum病斑直徑的影響Fig.1 Effects of T-2 treatment on the lesion diameter of potato tuber slices inoculated with F. sulphureum

由圖1可知，T-2處理能有效抑制F. sulphureum損傷接種塊莖切片病斑直徑的擴(kuò)展。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，處理和對照的病斑直徑均逐漸擴(kuò)大，但處理切片的病斑直徑低于對照，處理后第6天和第7天分別低于對照39.6%和40.7%。

2.2 T-2處理對塊莖PAL和4CL活性的影響

圖2 T-2 處理對馬鈴薯塊莖切片 PAL（A）和4CL（B）活性的影響Fig.2 Effects of T-2 treatment on activities of PAL (A and 4CL (B in potato tubers slices

由圖2可知，處理及對照的PAL活性整體呈先升高后降低再小幅升高的趨勢，但處理明顯高于對照。T-2處理后在第3天出現(xiàn)最高峰并在第6天出現(xiàn)了次高峰，對照組在第3天出現(xiàn)峰值后逐漸下降并在第6天出現(xiàn)最高峰，處理后第3天和第6天分別高于對照79.42%和41.69%（圖2A）。隨著貯藏時(shí)間的延長，對照和處理塊莖的4CL活性總體呈現(xiàn)先升高后下降再升高的趨勢，且處理組的4CL活性均高于對照。處理和對照組分別在第3天達(dá)到最高峰，在第6天達(dá)到次高峰，處理后第3天和第6天分別高于對照51.11%和28.23%（圖2B）。

2.3 T-2處理對塊莖木質(zhì)素、總酚、類黃酮和花青素含量的影響

圖3 T-2處理對馬鈴薯塊莖切片木質(zhì)素（A）、總酚（B）、B類黃酮（C）和花青素（D）含量的影響Fig. 3 Effects of T-2 treatment on contents of lignin total phenolic flavonoids and anthocyanin in potato tuber slices

培養(yǎng)期間對照及處理切片的木質(zhì)素含量整體呈現(xiàn)先增后降再升高再下降最后升高的趨勢，同時(shí)在第2天和第4天出現(xiàn)高峰，第5天以后均持續(xù)上升。T-2處理者的木質(zhì)素含量整體高于對照，在第2天高出對照38.1%（圖3A）。對照和處理切片總酚和類黃酮含量總體呈現(xiàn)先增后降的趨勢并均在第4天達(dá)到高峰值，T-2處理者的總酚和類黃酮含量高于對照，第4天時(shí)分別高出對照16.31%和28.05%，但在培養(yǎng)的后期（第6天和第7天），對照和處理總酚和類黃酮含量差異不大（圖3B、C）。對照和處理切片花青素的含量呈單峰形變化，峰值在第4天出現(xiàn)，在培養(yǎng)后期又有所增高，處理者的花青素含量明顯高于對照，在第4天高于對照36.27%（圖3D）。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度T-2處理可以有效抑制馬鈴薯塊莖切片損傷接種F. sulphureum的病斑直徑擴(kuò)展，其作用機(jī)理與增強(qiáng)苯丙烷代謝密切相關(guān)。由于T-2處理提高了塊莖切片的PAL和4CL活性，促進(jìn)了木質(zhì)素、總酚、類黃酮以及花青素的積累，表明T-2可作為激發(fā)子誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖的抗病性。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，激發(fā)子處理具有促進(jìn)馬鈴薯塊莖愈傷的能力。本研究所觀察到的PAL與4CL活性分別在第3天和第6天出現(xiàn)了峰值的結(jié)果表明，T-2處理參與了塊莖愈傷過程中2 個(gè)關(guān)鍵階段，即封閉層的形成和傷口周皮的形成[17]。PAL是催化苯丙烷途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶，生成的反式-肉桂酸經(jīng)過特定的生物合成途徑形成用于組裝到軟木酯多酚的前體物質(zhì)[18]。然而在封閉層的形成和傷口周皮形成初期的過程中，有軟木酯多酚和軟木酯多聚脂肪族化合物的積累[19-21]。因此，認(rèn)為T-2作為一種激發(fā)子，能夠促進(jìn)苯丙烷代謝中的木質(zhì)素，木栓質(zhì)和胼胝質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的大量積累[17]，最終形成多酚類化合物[18]。軟木酯多酚以固定的方式進(jìn)入傷口附近的薄壁細(xì)胞[17]，并且作為一種機(jī)械屏障促進(jìn)傷口的愈合，防止病原物的侵入和單端孢霉烯族毒素的滲透和擴(kuò)散。另外，本課題組前期研究表明，激發(fā)子能夠明顯地提高馬鈴薯塊莖總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量[22-23]。馬鈴薯中存在原花青素，而原花青素是一大類多酚物質(zhì)的總稱，具有強(qiáng)有力的抗氧化，清除自由基的功能[24]。在植物的次生代謝中，PAL活性是植物合成花青素等次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶，H2O2是植物細(xì)胞中PAL所必需的信號(hào)分子，同時(shí)H2O2對花青素合成有更為直接的促進(jìn)作用[25]。所以當(dāng)PAL的活性增高后，花青素的含量也隨之增高。

綜上所述，低質(zhì)量濃度T-2可作為一種激發(fā)子通過激活苯丙烷代謝來誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖對干腐病的抗病性，但T-2處理是如何促進(jìn)塊莖愈傷結(jié)構(gòu)形成的尚有待進(jìn)一步研究。

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T-2 Toxin at Low Concentration Activates Phenylpropanoid Pathway in Potato Tubers

ZHAO Ying XUE Huali BI Yang*′TANG Yamei SHEN Keping
(College of Food Science and Engineering Gansu Agricultural University Lanzhou 730070′China)

Dry rot, caused by Fusarium sulphureum spp., is one of the most important postharvest diseases of potato tubers in Gansu province. Potato tuber slices (cv. Long Shu No.3) were treated with T-2 toxin at 1 μg/mL. The effi cacy of T-2 toxin treatment on the lesion diameter of potato tuber slices inoculated with F. sulphureum, the activities of key enzymes involved in phenylpropanoid pathway and metabolites were investigated. The results showed that T-2 toxin treatment signifi cantly decreased lesion diameter of potato tuber slices inoculated with F. sulphureum, and enhanced the activities of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and coumaric acid-coenzyme A ligase (4CL), and also improved the accumulation of lignin, total phenolic compounds, fl avonoids and anthocyanin. It is suggested that T-2 toxin treatment at lower concentration induces resistance against dry rot in harvested potato tubers by activating phenylpropanoid pathway.

pot ato; T-2 toxin; induced resistance

TS255.1

A

1002-6630（2015）06-0232-04

10.7506/spkx1002-6630-201506044

2014-07-10

國家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA101607）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1308RJZA280）

趙瑩（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)椴珊笊飳W(xué)與技術(shù)。E-mail：15095315053@163.com

*通信作者：畢陽（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)椴珊笊飳W(xué)與技術(shù)。E-mail：biyang@gsau.edu.cn