姜向陽，鄒榮婕′2，徐英江，宋向軍，宮向紅，劉慧慧，田秀慧，孫國華，劉 云，安紅紅，張秀珍′*

（1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264006；2.煙臺(tái)山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006； 3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

高效液相色譜法測(cè)定喹噁林類藥物對(duì)刺參組織DNA的氧化損傷

姜向陽1，鄒榮婕1′2，徐英江1，宋向軍1，宮向紅1，劉慧慧1，田秀慧1，孫國華1，劉 云3，安紅紅3，張秀珍1′*

（1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264006；2.煙臺(tái)山水海產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006； 3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

為探索喹噁林類藥物在刺參養(yǎng)殖中使用的安全性問題，采用高效液相色譜-紫外法對(duì)喹噁林類藥物引起刺參組織DNA氧化損傷效應(yīng)進(jìn)行研究。采集經(jīng)過不同添加劑量、不同時(shí)間喹噁林藥物處理過的刺參組織，提取DNA，酶解后用高效液相色譜-紫外法對(duì)DNA氧化損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果表明：高效液相色譜-紫外檢測(cè)法，操作簡單，具有廣泛的適用性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，靈敏度高，并且樣品用量少，分析速度快。8-OHdG的含量隨著乙酰甲喹質(zhì)量濃度的增加和處理時(shí)間的延長而顯著增加（P＜0.05），存在質(zhì)量濃度-反應(yīng)、時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系，并且是一個(gè)持續(xù)性的過程。喹烯酮對(duì)DNA的氧化損傷也是隨著添加劑量的增加而顯著加重（P＜0.05）。說明乙酰甲喹和喹烯酮能引起刺參組織DNA的氧化損傷，對(duì)其遺傳物質(zhì)具有一定的遺傳毒性，因此需要規(guī)范喹噁林類藥物在刺參養(yǎng)殖中的使用。關(guān)鍵詞：喹噁林；刺參；DNA氧化損傷；高效液相色譜法

DNA氧化損傷是指由活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）損傷DNA堿基而產(chǎn)生了DNA加合物，從而造成DNA分子損傷。8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxguanosine，8-OHdG）是DNA氧化損傷的主要修飾產(chǎn)物之一，其分子式為C10H13N5O5，主要是由化學(xué)致癌物代謝活化和電離輻射等過程產(chǎn)生的大量活性氧簇直接攻擊DNA中的鳥嘌呤，使脫氧鳥苷（deoxyguanosine，dG）氧化為8-OHdG[1]，見圖1。8-OHdG一旦避開了機(jī)體自身修復(fù)，就可能成為致突變、致畸、致癌的啟動(dòng)因子。8-OHdG在體內(nèi)穩(wěn)定存在，為代謝終產(chǎn)物，只能通過DNA氧化損傷途經(jīng)形成，因此8-OHdG的含量可反映體內(nèi)DNA的氧化損傷程度，被公認(rèn)為是20多種DNA氧化損傷產(chǎn)物中最主要的標(biāo)記物之一[2]。因此測(cè)定機(jī)體8-OHdG含量對(duì)評(píng)估體內(nèi)氧化損傷程度、氧化應(yīng)激與DNA損傷的相互關(guān)系具有重要意義。

圖1 8-OHdG的形成Fig.1 8-OHdG formation by oxygen radicals

喹噁啉類藥物是指具有喹噁啉-Nl,N4-二氧化物基本結(jié)構(gòu)的一類化學(xué)合成的具有抗菌和促生長作用的動(dòng)物專用藥，主要包括卡巴氧、喹乙醇、喹賽多、喹烯酮和乙酰甲喹等，喹烯酮和乙酰甲喹是國內(nèi)獨(dú)立合成的喹噁啉類新獸藥[3-4]。喹烯酮化學(xué)名稱為3-甲基-2-苯乙烯酮基-喹噁林-1,4-二氧化物，分子式為C18H14N2O3，結(jié)構(gòu)式如圖2A所示，該藥物可促進(jìn)動(dòng)物生長并提高飼料轉(zhuǎn)化率，對(duì)多種腸道致病菌（特別是革蘭氏陰性菌）有抑制作用。乙酰甲喹化學(xué)名稱為3-甲基-2-乙酰基喹噁林-1,4-二氧化物，分子式為C11H10N2O3，結(jié)構(gòu)式如圖2B所示，該藥物為廣譜抗菌藥，對(duì)革蘭氏陰性菌作用強(qiáng)于陽性菌，對(duì)密螺旋體作用較強(qiáng)，且該類藥物能顯著促進(jìn)動(dòng)物生長。

刺參作為名貴的滋補(bǔ)良品和美膳佳肴，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，市場需求量日益增大，促進(jìn)了刺參養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展。隨著工廠化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，藥物的使用更為頻繁，對(duì)藥物的安全性應(yīng)該更為關(guān)注[5]。研究表明喹乙醇、乙酰甲喹等喹噁啉類藥物具有致突變作用和潛在的致癌作用[6]，因此該類藥物的安全性問題逐漸受到重視。本實(shí)驗(yàn)以藥浴乙酰甲喹、飼喂含有喹烯酮藥物的刺參為研究對(duì)象，采用酶解法將DNA裂解后，用高效液相色譜-紫外（high performance liquid chromatographyultraviolet，HPLC-UV）法測(cè)定刺參樣品中8-OHdG含量，以此反映樣品DNA的氧化損傷程度，從分子水平研究該類藥物對(duì)刺參遺傳毒性，探討該類藥物在刺參養(yǎng)殖過程中使用的安全性。

圖2 乙酰甲喹（A）和喹烯酮（B）的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structures of MEQ and QCT

目前8-OHdG的檢測(cè)方法主要有：32P后標(biāo)記法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜-電化學(xué)分析法、氣相色譜-質(zhì)譜分析法、高效毛細(xì)管電泳法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、HPLC-UV分析法等[2,7]，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-UV法，該方法操作簡單，具有廣泛的適用性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，靈敏度高，樣品用量少，分析速度快。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)刺參幼參由山東省海洋與漁業(yè)廳黃河三角洲海洋漁業(yè)科研推廣中心提供，選取大小均一，平均體質(zhì)量0.6 g左右的幼參，于300 L塑料水槽中（水體體積為250 L）暫養(yǎng)7 d后隨機(jī)分組用于實(shí)驗(yàn)。

dG（CAS號(hào)：312693-72-4，純度≥99%）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）、堿性磷酸酶、蛋白酶K、乙酸銨（分析純）、苯酚（分析純）、氯仿（分析純） 生工生物（上海）股份有限公司；8-OHdG（CAS號(hào)：88847-89-6，純度≥98%）、蛇毒磷酸二酯酶 美國Sigma公司；喹烯酮、乙酰甲喹 山東康樂動(dòng)物保健有限公司；磷酸二氫鉀（分析純） 天津永達(dá)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 德國Meker公司；超純水（由超純水儀制備）。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器） 美國Thermo公司；Milli-Q Gradient超純水儀 法國Millipore公司；小型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；金屬浴 杭州博日公司。

1.3 方法

暫養(yǎng)后的刺參幼參隨機(jī)分為11 組，每組設(shè)3 個(gè)平行，每個(gè)水槽500 頭刺參。乙酰甲喹用藥方式為每次換水后直接潑灑到水體中，質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4、6 mg/L；喹烯酮用藥方式為拌餌料投喂，添加量為10、20、50、80、100 mg/kg餌料，每天按照刺參生物量的5%投喂，最后一組為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)期間水溫與實(shí)際保苗生產(chǎn)水溫一致，變化范圍為18～26 ℃。溶解氧保持在6～8 mg/L，24 h持續(xù)充氣，pH值為7.8～8.2，鹽度為30～32。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)抽取飼養(yǎng)了52 d時(shí)刺參樣品進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)不同質(zhì)量濃度乙酰甲喹和喹烯酮對(duì)刺參DNA氧化損傷程度的影響；隨機(jī)抽取藥浴于4 mg/L乙酰甲喹7、12、20、32、40、52、66 d的刺參DNA進(jìn)行8-OHdG含量的測(cè)定，檢驗(yàn)藥浴時(shí)間長短對(duì)刺參DNA氧化損傷程度的影響。1.3.1 溶液的配制

dG標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制：精確稱取10 mg dG標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解并定容至100 mL，配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4℃冰箱保存，有效期2 個(gè)月。

8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制：將1mg 8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解并定容至10 mL，配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置4 ℃冰箱保存，有效期2 個(gè)月。

dG和8-OHdG混合標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：分別移取1 mL的dG和8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配成0.05～10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，置4 ℃冰箱保存，有效期1 個(gè)星期。

1.3.2 DNA的提取

分別隨機(jī)抽取每組實(shí)驗(yàn)中活性良好的刺參5 頭，取其體壁（含肌肉）組織，提取總DNA。DNA提取采用優(yōu)化過的CTAB法[8]：取200 mg刺參組織樣品用液氮磨至粉狀，加入700 μL 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，同時(shí)加入8 μL 20mg/mL的蛋白酶K，置于55 ℃水浴槽，水解3～5 h，其間每0.5h輕輕搖動(dòng)，直至裂解澄清。然后加入700 μL苯酚-氯仿（1∶1，V/V），顛倒2～3 min，使兩者混合均勻，12 000 r/min離心15 min，取上清液，加入等體積氯仿混勻2～3 min。離心，重復(fù)上步直至上清液澄清無渾濁，取上清液，再加入2 倍體積的無水乙醇，—20 ℃沉淀2 h，離心，晾干沉淀，加入50 μL超純水溶解。

1.3.3 DNA的氧化損傷實(shí)驗(yàn)

參考孫詠梅等的方法[9]，將50 μL對(duì)照組刺參DNA中加入50 μL磷酸緩沖溶液（pH 6.8、10 mmol/L），95 ℃加熱10 min后，冰上驟冷3 min，加入50 μL FeSO4（1.3 mmol/L）、50 μL乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic，EDTA)（6.5 mmol/L）后，再加入50 μL H2O2（100 mmol/L），37 ℃反應(yīng)2 h，通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生?OH以攻擊DNA樣品，進(jìn)而產(chǎn)生8-OHdG。

1.3.4 DNA酶解過程

DNA酶解參考宋玉玲等[10]的方法，將提取的50 μL DNA樣品溶液中加入10 U的DNase Ⅰ、20 U的堿性磷酸酶以及0.05 U蛇毒磷酸二酯酶，輕微振蕩混勻后在37 ℃條件下避光酶解24 h。酶解反應(yīng)完成后′用0.45 μm濾膜過濾，濾液供HPLC分析。

1.3.5 HPLC條件

色譜柱為ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長300 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為甲醇- KH2PO4溶液（50 mmol/L，pH 3.5）（7∶93，V/V），等度洗脫。

1.4 數(shù)據(jù)分析

HPLC采用外標(biāo)法定量，數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，最小顯著差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

色譜條件采用汪莉君等[11]的方法并結(jié)合儀器和色譜柱情況略加改進(jìn)，對(duì)流動(dòng)相中甲醇與50 mmol/L KH2PO4（pH 3.5）的比例進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，最后確定的比例為體積比7∶93，由圖3可看出，dG和8-OHdG峰形良好，且與雜質(zhì)峰能獲得良好分離。8-OHdG的質(zhì)量濃度在0.05～10 μg/mL范圍內(nèi)，線性良好，8-OHdG的線性方程為：Y=0.000 5X＋0.006 8（R2=1.000 0）。取50 ?L質(zhì)量濃度為0.05 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，經(jīng)1.3.4節(jié)方法處理，HPLC分析后，RSN不小于3條件下確定方法的檢出限為0.05 ?g/mL。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of dG and 8-OhdG standards

2.2 方法的回收率、精密度和8-OHdG的確定

分別取50 μL質(zhì)量濃度為0.05、0.25、1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，經(jīng)1.3.4節(jié)方法處理后，用于HPLC分析，進(jìn)行回收率測(cè)定。結(jié)果顯示，dG和8-OHdG的回收率為91.3%～99.5%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）和批間RSD均小于4%，說明該方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定刺參組織樣品酶解液中dG和8-OHdG的含量。在優(yōu)化好的條件下，將氧化損傷實(shí)驗(yàn)得到的樣品重復(fù)測(cè)定6 次，記錄色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，測(cè)得的8-OHdG的平均保留時(shí)間為15.185 min，峰面積的平均值為0.273 mAU?min，對(duì)應(yīng)的RSD分別為0.10%和3.86%。8-OHdG的平均質(zhì)量濃度為0.49 μg/mL，RSD為1.86%，表明該方法的精密度好。

將1.3.3節(jié)中得到的損傷后的DNA按照1.3.4節(jié)方法處理后進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果見圖4A，測(cè)定液中加入0.5 mL 8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0mg/L）后的HPLC圖見圖4B，在15.173 min處的色譜峰相比較圖4A 15.197 min處的色譜峰，峰形不變，峰高增加，表明圖4A中15.197 min處的色譜峰即為8-OHdG，說明該酶解和儀器方法適用于本實(shí)驗(yàn)。

圖4 DNA損傷（A）和加標(biāo)（B）樣品色譜圖Fig.4 Liquid chromatograms of sample with DNA damage (A and spiked sample (B)

2.3 8-OHdG的穩(wěn)定性

在優(yōu)化的條件下，每隔1 h對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣，HPLC測(cè)定。結(jié)果表明，8-OHdG酶解液在室溫條件下至少可以穩(wěn)定24 h。

2.4 乙酰甲喹藥浴質(zhì)量濃度、藥浴時(shí)間對(duì)刺參DNA氧化損傷程度的影響

應(yīng)用建立的方法分別對(duì)經(jīng)過不同藥浴質(zhì)量濃度和藥浴時(shí)間乙酰甲喹處理過的刺參DNA樣品進(jìn)行8-OHdG分析。藥浴52 d時(shí)不同質(zhì)量濃度乙酰甲喹對(duì)刺參的影響，見圖5。刺參DNA中8-OHdG的含量隨乙酰甲喹質(zhì)量濃度增高而增高，呈濃度依賴性升高，乙酰甲喹質(zhì)量濃度的變化對(duì)刺參組織DNA中8-OHdG含量變化有顯著影響（P＜0.05）。由圖6可見，4 mg/L乙酰甲喹條件下，隨著作用時(shí)間的延長，8-OHdG含量顯著增加（P＜0.05），呈現(xiàn)時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都表明藥物誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生了氧化性DNA損傷，DNA損傷是導(dǎo)致基因突變的重要基礎(chǔ)，說明乙酰甲喹對(duì)刺參幼參有一定的遺傳毒性。

圖5 乙酰甲喹質(zhì)量濃度與刺參組織DNA中8-OHdG含量的關(guān)系Fig.5 Relationship between MEQ concentration and 8-OHdG content

圖6 乙酰甲喹（4 mg/L）藥浴時(shí)間與8-OHdG含量的關(guān)系Fig.6 Relationship between MEQ medicated bath and 8-OHdG content

2.5 飼料中不同添加劑量喹烯酮對(duì)刺參DNA氧化損傷程度的影響

將飼喂不同劑量喹烯酮52 d時(shí)的刺參DNA樣品進(jìn)行HPLC分析（圖7）表明，刺參DNA中的8-OHdG的含量隨喹烯酮添加劑量的升高而增多，喹烯酮的添加劑量與8-OHdG的含量呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，差異顯著（P＜0.05），表明藥物誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生了DNA氧化損傷，喹烯酮具有一定的遺傳毒性。

圖7 喹烯酮添加量與8-OHdG含量的關(guān)系Fig.7 Relationship between QCT addition and 8-OHdG content

3 討 論

遺傳毒性是指環(huán)境中的理化因素作用于有機(jī)體，使其遺傳物質(zhì)在染色體水平、分子水平和堿基水平上受到各種損傷，從而造成的毒性作用。8-OHdG作為體內(nèi)DNA氧化損傷的主要標(biāo)志物之一，是氧化代謝終產(chǎn)物，只能通過DNA氧化損傷途徑產(chǎn)生8-OHdG的致突變性主要表現(xiàn)在特異性堿基丟失，鄰近嘧啶的錯(cuò)讀，以及損傷部位腺嘌呤的錯(cuò)誤插入[12]。選取8-OHdG作為體內(nèi)DNA氧化損傷標(biāo)志物主要由以下幾方面原因[2]：1）8-OHdG在體內(nèi)穩(wěn)定存在，一旦形成不再被機(jī)體進(jìn)一步代謝；2）8-OHdG不能由細(xì)胞內(nèi)外的dG通過非DNA氧化途徑形成，分析組織細(xì)胞核DNA及線粒體DNA中8-OHdG可反映體內(nèi)DNA氧化損傷程度。

喹噁林類藥物中的喹乙醇和卡巴氧，目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖上已經(jīng)禁止使用，乙酰甲喹和喹烯酮作為我國自主研發(fā)的一類新型喹噁林類藥物，對(duì)畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物防病作用效果顯著。1997年Acree等[13]研究喹噁啉類藥物在脫氧代謝過程中發(fā)現(xiàn)有氫氧自由基產(chǎn)生，過多的自由基可以和DNA或者蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致DNA斷裂、蛋白質(zhì)損傷等氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞組織有很強(qiáng)的破壞作用。含有N—O基團(tuán)的乙酰甲喹、喹烯酮在脫氧過程中也會(huì)產(chǎn)生類似的毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，影響機(jī)體功能。Ihsan[14-15]、王旭[16]等系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了乙酰甲喹的遺傳毒性，對(duì)乙酰甲喹進(jìn)行了細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)、染色體畸變實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)微核實(shí)驗(yàn)和繁殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明了乙酰甲喹具有潛在的基因毒性和胚胎毒性。很多的研究結(jié)果也證明乙酰甲喹在細(xì)胞水平具有一定的遺傳毒性，主要表現(xiàn)為細(xì)胞存活率下降、DNA損傷和細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，能誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)基因位點(diǎn)的突變[17-18]。張偉等[19]發(fā)現(xiàn)，乙酰甲喹微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性；在加與不加S9時(shí)，細(xì)胞的畸變率均大于10%，為陽性，并呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。上述結(jié)果顯示乙酰甲喹具有一定的遺傳毒性。

很多研究結(jié)果也證實(shí)了喹烯酮具有一定的致突變性和遺傳毒性。Chen Qian等[20]報(bào)道，喹烯酮以5～15 mg/L作用Vero細(xì)胞，無論加S9處理與否，都出現(xiàn)顯著的DNA損傷。班曼曼[21]利用SCGE技術(shù)也證實(shí)喹烯酮對(duì)Chang Liver和L-02細(xì)胞DNA均有顯著損傷。張偉[19]采用Ames實(shí)驗(yàn)對(duì)喹烯酮的遺傳毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在不加S9提取物情況下，喹烯酮對(duì)菌株TA 97、TA98、TA100和TA1537具有一定的致突變性。涂宏剛等[22]在V79細(xì)胞hgpr基因突變實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)喹烯酮在10 μg/mL的劑量下引起V79細(xì)胞hgpr基因突變率變化與溶劑對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。靳溪[23]、陳開跑[24]等在HepG2細(xì)胞中以不同質(zhì)量濃度給予喹烯酮，進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳和彗星實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，喹烯酮能夠?qū)epG2細(xì)胞造成顯著的DNA損傷效應(yīng)，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。Wang Di等[25]研究發(fā)現(xiàn)喹烯酮暴露導(dǎo)致Balb/c小鼠DNA損傷，小鼠肝臟和腎臟的ROS水平明顯上升以及抗氧化系統(tǒng)受到明顯抑制，氧化應(yīng)激是喹烯酮引起體內(nèi)遺傳毒性的重要原因。程序外DNA合成實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，喹烯酮10～20 μg/mL能引起人外周血淋巴細(xì)胞程序外DNA合成顯著增加，呈劑量反應(yīng)關(guān)系，表明喹烯酮能引起人外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷[26]。

本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)新型喹噁林類乙酰甲喹和喹烯酮藥物處理過的刺參樣品進(jìn)行8-OHdG含量的測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，兩類藥物都能引起刺參組織DNA的氧化損傷，并且隨著藥物濃度增加和時(shí)間延長，8-OHdG含量顯著增加（P＜0.05），呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)、時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系，并且是一個(gè)持續(xù)性的過程，表明乙酰甲喹和喹烯酮在分子水平具有一定的遺傳毒性。目前對(duì)乙酰甲喹和喹噁林類藥物的遺傳機(jī)制研究處于起步階段，尚需更多研究對(duì)此加以證實(shí)，以確認(rèn)其安全性，并制定此類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的使用規(guī)范，以促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

[1] 張德莉′朱圣姬′羅光富′等. 自由基與DNA氧化損傷的研究進(jìn)展[J]. 三峽大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版′2004′26(6): 563-567.

[2] 徐永俊′徐順清. DNA氧化損傷生物標(biāo)志物8-OH-dG的檢測(cè)及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 癌變·畸變·突變′2002′14(1): 50-53.

[3] 吳永寧′邵兵′沈建忠. 獸藥殘留檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社′2007: 621-626.

[4] 張華海. 喹噁啉類在大鼠和豬肝微粒體中脫氧速率與肝細(xì)胞中毒性研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[5] 張春云′王印庚′榮小軍′等. 國內(nèi)外海參自然資源、養(yǎng)殖狀況及存在問題[J]. 海洋水產(chǎn)研究′2004′25(3): 89-97.

[6] 王旭′談自強(qiáng)′黃玲利′等. 獸用喹噁林類遺傳毒性研究進(jìn)展[J]. 中國獸藥雜志′2013′47(5): 62-65.

[7] 趙燕′郝衛(wèi)東. 8-羥基-2′-脫氧鳥苷的生物學(xué)意義及其尿中含量的測(cè)定方法[J]. 癌變·畸變·突變′2007′19(5): 418-420.

[8] 榮俊冬′張迎輝′鄭志雷′等. 不同提取緩沖液對(duì)三尖杉DNA提取質(zhì)量的影響[J]. 廣東林業(yè)科技′2013(5): 22-25.

[9] 孫詠梅′戴樹桂′裘著革. DNA加合物8-羥基脫氧鳥苷特性研究[J]. 上海環(huán)境科學(xué)′2001′20(9): 409-413; 459.

[10] 宋玉玲′汪海林. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定氧化損傷標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷[J]. 色譜′2010′28(12): 1123-1127.

[11] 汪莉君′邵華′許光′等. 高效液相色譜-紫外法檢測(cè)尿中8-羥基脫氧鳥苷[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志′2008′18(6): 1030-1032.

[12] PILGE A R?DIGER H W. 8-Hydroxy-2-deoxyguanosine as a marker of oxidative DNA damage related to occupationaland environmental exposures[J]. International Archives of Occupational and Environmental Health′2006′80: 1-15.

[13] ACREE W JOYCE J POWELL J et al Thermodchemical and theoretical study of some quinmoxaline 1′4-dioxides and of pyrazine 1′4-dioxide[J]. Journal of Organic Chemistry′1997′62: 3722-3726.

[14] IHSAN A WANG X TU H G et al Genotoxicity evaluation of mequindox in different short-term tests[J]. Food and Chemical Toxicology′2013′51: 330-336.

[15] IHSAN A WANG X LIU Z Y et al Long-term mequindox treatment induced endocrine and reproductive toxicity via oxidative stress in male Wistar rats[J]. Toxicology and Applied Pharmacology′2011′252: 281-288.

[16] 王旭′IHSAN A′黃先菊′等. 乙酰甲喹的毒理學(xué)研究[C]//科技引領(lǐng)產(chǎn)業(yè)、支撐跨越發(fā)展: 第六屆湖北科技論壇論文集萃. 2011: 220-221.

[17] LIU Jing MAN Quyang JIANG Jun et al Mequindox induced cellular DNA damage via generation of reactive oxygen species[J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis′2012′741: 70-75.

[18] 母培強(qiáng)′劉菁′唐先青′等. 乙酰甲喹的細(xì)胞毒性及其羰基還原和羥化代謝[J]. 畜牧與獸醫(yī)′2012′44(增刊1): 375-376.

[19] 張偉. 喹烯酮臨床前毒理學(xué)研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)′2007.

[20] CHEN Qian TANG Shusheng JIN Xi et a1. Investigation of the genotoxicity of quinocetone carbadox and olaquindox in vitro using vero cells[J]. Food and Chemical Toxicology′2009′47(2): 328-334.

[21] 班曼曼. 喹噁啉類藥物及其代謝物致人源肝細(xì)胞毒性研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)′2009.

[22] 涂宏剛′戴夢(mèng)紅′姚敏′等. 喹噁啉類藥物對(duì)V79細(xì)胞hgprt基因位點(diǎn)的突變效應(yīng)[J]. 毒理學(xué)雜志′2007′21(4): 335.

[23] 靳溪′陳倩′鄒家杰′等. 喹烯酮致HepG2細(xì)胞DNA損傷效應(yīng)的研究[C]//中國環(huán)境誘變劑學(xué)會(huì)第14屆學(xué)術(shù)交流會(huì)議論文集. 2009: 125-130.

[24] 陳開跑′陳倩′靳溪′等. 喹噁林類藥物致HepG2細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)[J]. 中國獸醫(yī)雜志′2010′46(5): 90-92.

[25] WANG Di ZHONG Ying LUO Xiao et al Pu-erh black tea supplementation decrease quinocetone-induced ROS generation and oxidative DNA damage in Ballb/c mice[J]. Food and Chemical Toxicology′2011′49(2): 477-484.

[26] 黃玲利′李娟′王旭′等. 喹烯酮的食品安全性研究進(jìn)展[J]. 中國獸藥雜志′2013′47(6): 56-59.

Determination of Oxidative DNA Damage Induced by Quinoxaline in Apostichopus japonicas Tissue Using High Performance Liquid Chromatography

JIANG Xiangyang1′ZOU Rongjie1′2′XU Yingjiang1′SONG Xiangjun1′GONG Xianghong1′LIU Huihui1′TIAN Xiuhui1′SUN Guohua1′LIU Yun3′AN Honghong3′ZHANG Xiuzhen1′*
(1. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology Shandong Marine Resource and Environment Research Institute Yantai 264006′China; 2. Yantai Shanshui Seafood Co Ltd.′Yantai 264006′China; 3. College of Food Science and Technology Shanghai Ocean University Shanghai 201306′China)

8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) is one of the main modified products from oxidative DNA damage when deoxyguanosine (dG) is oxidized by a large amount of active oxygen species (ROS). Once 8-OhdG has avoided to be repaired within the body, it maybe the initiation factor causing mutagenic, teratogenic and carcinogenic effect. 8-OHdG is a metabolic end product that is stable within the body. It is not formed by non-DNA oxidation pathway outside the cell. The content of 8-OHdG can refl ect the degree of oxidative damage in DNA. Thus, it is important to determine the content of 8-OHdG in order to evaluate the interaction between oxidative damage, oxidative stress and DNA damage in the body. The quinoxaline-induced DNA oxidative damage in Apostichopus japonicas tissues was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) in this study. Sea cucumber tissue treated with quinoxalines at different concentrations and for different time periods were collected. DNA were extracted and treated enzymatically, and then 8-OHdG as an indicator of DNA oxidative damage was measured and analyzed by HPLC. The results showed that the HPLC-UV method displayed a wide applicability, stability and accuracy, high sensitivity, less samples and fast analysis. The 8-OHdG content remarkably increased along with increasing concentration and processing time of mequindox. The dose- and time-dependent response relationship existed, which were a continual process. The oxidative damage to DNA caused by quinocetones signifi cantly increased with increasing concentration (P lt; 0.05). It was indicated that there was obvious genetic toxicity resulting from oxidative DNA damage caused by mequindox and quinocetone in sea cucumber. Thus, it is necessary to control strictly quinoxalines applied in sea cucumber.

quinoxaline; Apostichopus japonicas; oxidative DNA damage; high performance liquid chromatography (HPLC)

S859.79

A

1002-6630（2015）06-0211-05

10.7506/spkx1002-6630-201506040

2014-05-25

山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012GHY11517）；煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012134）；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201105013）；水生動(dòng)物營養(yǎng)與飼料泰山學(xué)者崗位項(xiàng)目（2007-2012）

姜向陽（1980—），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物疫病防治。E-mail：jxy0535@126.com

*通信作者：張秀珍（1964—），女，研究員，本科，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：zxz0535501@126.com