石 浩，王仁才*，龐 立，仇振華，劉吉凱

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

糖棗多糖的單糖組成分析

石 浩，王仁才*，龐 立，仇振華，劉吉凱

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

研究糖棗多糖的單糖組成。以3 a生糖棗為試材，采用糖腈乙酸酯衍生化法，利用氣相色譜儀對5 個棗多糖組分進(jìn)行單糖成分測定。結(jié)果表明，在糖棗多糖的單糖組成中，以木糖醇、葡萄糖、半乳糖所含比例較高，分別占單糖總含量的19.4%、18.5%、24.2%（組分DTC中葡萄糖比例高達(dá)36.4%）；鼠李糖、核糖、阿拉伯糖和甘露糖，所占含量次之，分別為7.1%、6.5%、8.1%、7.9%；巖藻糖、木糖含量較低，分別只占總單糖質(zhì)量的5.0%、3.4%（組分DTB1中巖藻糖只占0.80%，組分DTB2中木糖只占0.70%）。由此可知，糖棗多糖中單糖組成的差異性大。

棗；多糖；組分；單糖

棗果又稱紅棗，具有豐富營養(yǎng)價值，用途范圍廣，食療價值高，可應(yīng)用于保健飲料的開發(fā)[1]。它是當(dāng)今社會上等的滋補(bǔ)食品，棗不僅是滋補(bǔ)佳品，而且也是一味傳統(tǒng)的中藥，因富含營養(yǎng)和保健成分而享譽(yù)中外，為我國傳統(tǒng)藥食兩用果品[2-3]?，F(xiàn)代研究表明，棗果中主要功能成分有：多糖[4-6]、環(huán)磷酸腺苷[7]、蘆丁[8]、多酚類[9]、黃酮類[10]、三萜酸[11]、皂苷[12]等。功能性多糖是指對生物具有一定生理作用的一類較高分子質(zhì)量的碳水化合物。棗果中含有豐富的棗多糖，現(xiàn)代藥理研究表明，其主要生理活性有：抗補(bǔ)體活性、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和抗癌功能[13]，健脾益胃、養(yǎng)心安神、補(bǔ)氣養(yǎng)血，提高酶活性[14]、保肝[15]、抗氧化[16-17]、抗疲勞[18]、抗衰老、提高機(jī)體免疫力[19-20]等重要功效。目前，對多糖中單糖的測定主要方法有：薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法[21]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[22]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法[23]、GC-質(zhì)譜（GC-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用法[24]。TLC法相對于后2 種方法來講，其分離效果均要低于后者，但對實驗條件要求不高，可做簡單測定；HPLC法分離效率較低，而且常用的示差折光檢測器的靈敏度也較低[25]；GC和GC-MS法兩者靈敏度都很高，分析效果好，非常適合單糖的測定。糖棗為湖南乃至南方地區(qū)分布及栽培廣泛的主要地方棗品種，現(xiàn)已成為當(dāng)?shù)毓麡洚a(chǎn)業(yè)的主要發(fā)展對象之一，通過對糖棗多糖的分析研究，對于促進(jìn)糖棗等地方棗樹資源的開發(fā)利用及其南方棗業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 a生糖棗 湖南衡陽玖一玉泉實業(yè)有限公司。

葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、巖藻糖、木糖醇 美國Sigma公司；無水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、98%濃硫酸、苯酚、三氟乙酸、醋酸酐、鹽酸羥氨、吡啶、甲醇（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2010氣相色譜儀、色譜柱：RTX-1701毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）、AUW220D電子天平 日本島津公司；ZW1105051705紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SB-3200D超聲波發(fā)生器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DR-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DHG-9246A電熱恒溫干燥箱、DK-S24恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品的制備

1.3.1.1 棗多糖的提取

轉(zhuǎn)紅期糖棗經(jīng)65 ℃干燥至恒質(zhì)量，粉碎過60 目篩，精確稱取棗粉50 g于1 000 mL燒杯中加蒸餾水750 mL，經(jīng)水浴超聲提取，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)約15 mL后，用100 mL無水乙醇萃取，靜置2 h后過濾。以多糖水溶液1/3體積加入Sevag試劑（氯仿-正丁醇（4∶1，V/V））混合振蕩20 min后靜置15 min，用分液漏斗除去水層與溶劑交界處的變性蛋白質(zhì)，取下層多糖水溶液重復(fù)多次直至除盡，備用。

1.3.1.2 棗多糖組分的分離

取150 mg/mL的多糖溶液3.0 mL，上樣于平衡好的DEAE-纖維素柱（直徑2.8 mm×100 mm）中，先用蒸餾水進(jìn)行洗脫，再用0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行分段梯度洗脫，每個濃度的洗脫體積為80 mL，5 mL一管流速為1.5 mL/min，苯酚-硫酸法跟蹤檢測每管洗脫液A490nm，濃縮每個洗脫組分；取上述濃縮組分上SephadexG-100葡聚糖柱（直徑2.8 mm×100 mm），以蒸餾水做洗脫液，收集洗脫液，5 mL一管流速為1 mL/min，苯酚-硫酸法跟蹤檢測每管洗脫液A490nm；共分離出5 個多糖組分，分別命名為：DTA、DTB1、DTB2、DTB3、DTC，各組分多糖干燥至恒質(zhì)量，備用。

1.3.1.3 多糖樣品的水解

準(zhǔn)確稱取分級純化的棗多糖樣品各50.0 mg，分別置于三角瓶中，加入4.0 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液10.0 mL，搖勻，100 ℃水浴鍋中水解10 h，取水解產(chǎn)物減壓蒸干，然后向其中加入10.0 mL甲醇，再次減壓蒸干，重復(fù)多次。

1.3.1.4 樣品衍生物的制備

各多糖樣品水解產(chǎn)物中依次加入50.0 mg鹽酸羥胺，5.0 mL吡啶，然后放入90 ℃水浴中45 min，振蕩，再加入5.0 mL乙酸酐，在90 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)45 min，進(jìn)行乙酰化衍生，產(chǎn)物減壓蒸干，得到糖腈乙酸酯衍生物，加入4.0 mL氯仿溶液溶解，溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，上機(jī)進(jìn)行GC分析。

1.3.2 單糖的GC測定

1.3.2.1 GC分析條件的確定

取各標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品5.0 mg混合，然后按1.3.1.4節(jié)衍生化后上機(jī)測定，通過尋找最佳儀器參數(shù)得到最佳分離效果。

1.3.2.2 不同單糖保留時間的確定

取單一標(biāo)準(zhǔn)單糖5.0 mg，按1.3.1.4節(jié)衍生化后上機(jī)測定，確定每種單糖的保留時間。

1.3.2.3 不同單糖線性關(guān)系考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用10 μL氣相針分別取已衍生化（鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、木糖醇）溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 μL，上機(jī)進(jìn)行GC分析，記錄色譜數(shù)據(jù)。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.4 供試品的測定與計算

多糖樣品按上述方法水解、衍生化后取4 μL上機(jī)測定，根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間確定多糖中單糖的種類；通過GC測得各單糖峰面積，根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖中不同單糖質(zhì)量濃度；通過體積求得相應(yīng)單糖質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC分析

2.1.1 GC條件的確定

由圖1可知，各峰分離效果較好。實驗確定的GC分析條件為：溫度180 ℃以3 ℃/min的速率程序升溫至230 ℃；氫離子火焰檢測器；檢測器溫度250 ℃；進(jìn)樣口溫度270 ℃；分流比50∶1；尾吹流量10.0 mL/min；氫氣流速40.0 mL/min；空氣流速400.0 mL/min；載氣為高純度氮?dú)?；流?.0 mL/min。

圖1 混合單糖GC圖GCFig.1 Gas chromatograms of mixed monosaccharide standards

2.1.2 不同單糖保留時間的確定

通過1.3.2節(jié)確定鼠李糖、核糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、木糖醇、甘露糖、葡萄糖、半乳糖保留時間，其出峰時間分別為8.0、8.5、8.9、9.16、9.88、12.2、14.5、15.3、16.0 min。

2.1.3 線性關(guān)系考察

通過1.3.2節(jié)做各單糖標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸實驗，得到各單糖線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)（表1）。由表1可知，各標(biāo)準(zhǔn)單糖在質(zhì)量濃度0.25～2.25 mg/mL間線性關(guān)系良好。

表1 回歸方程與線性范圍Table1 Regression equations and linear rangesanges

2.2 糖棗多糖中單糖分析

由表2可知，同組分多糖中單糖的含量差異較大。在DTA中木糖醇、半乳糖含量較高分別占31.4%、17.0%，其余單糖所占比例相差較小在3.5%～10.4%之間；在DTB1中半乳糖含量較高占27.2%，巖藻糖含量較低只占0.8%，其余單糖所占比例相差較小在6.5%～15.3%之間；在DTB2木糖醇、半乳糖含量較高分別占26.4%、20.5%，木糖含量較低只占0.7%，其余單糖所占比例相差較小在4.8%～15.8%之間；在DTB3半乳糖、葡萄糖含量較高分別占37.7%、 20.5%，巖藻糖、木糖含量較低只占1.8%、1.5%，其余單糖所占比例相差較小在5.1%～13.6%之間；在DTC中葡萄糖、半乳糖含量較高分別占36.4%、18.3%，巖藻糖含量較低只占0.9%，其余單糖所占比例相差較小在4.0%～12.4%之間；通過SPSS 17.0軟件方差分析P＜0.01可判斷，多糖中各單糖含量具有顯著性差異。

不同組分多糖中單糖的總含量也有一定差異（表2）。在已測定的9 種單糖中，5 組多糖其單糖總含量為18.47 mg，其中DTA、DTB1、DTB2、DTB3、DTC的單糖總含量依次為4.05、3.53、2.73、3.90、4.26 mg。

表2 5 組多糖的單糖組成分析結(jié)果Table2 Monosaccharide composition of five polysaccharides from jujubes mg

通過對5 組多糖中的單糖成分進(jìn)行GC測定，獲得GC圖（圖2）。由圖2可知，樣品多糖中單糖的分離效果較好，基本上能完全分開，這進(jìn)一步說明糖腈乙酸酯衍生化，毛細(xì)管色譜柱-GC法以及本實驗所采用的儀器參數(shù)適合對糖棗多糖組分中單糖的成分分析測定。

圖2 樣品多糖GC圖GCFig.2 GC chromatograms of reference samples

3 結(jié)論與討論

多糖屬于大分子類化合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單糖成分差異大。在已測定的9 種單糖中，糖棗多糖其主要單糖成分有木糖醇、葡萄糖、半乳糖占單糖總含量的62.1%，說明糖棗多糖主要是由這3 種單糖組成，而余下的6 種單糖只占單糖總含量的37.9%。

由于通過柱分離所得到多糖的極性大小、質(zhì)量大小、黏度大小、空間構(gòu)象等一些物理因素不一樣，其主要原因之一就是多糖間單糖的種類和含量不一樣[26]。在DTB2與DTB3中幾乎不含有木糖，DTA與DTC中幾乎不含有巖藻糖，在糖棗多糖中組分DTC與組分DTB2單糖含量相差達(dá)1.6 倍；在DTA中，木糖醇為主要組成單糖，高達(dá)31.4%，在DTB1中，半乳糖為主要組成單糖，高達(dá)27.2%，在DTB2中，木糖醇為主要組成單糖，高達(dá)26.4%，在DTB3中，半乳糖為主要組成單糖，高達(dá)37.7%，在DTC中，葡萄糖為主要組成單糖，高達(dá)36.4%。這不僅反映了多糖間單糖成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，同時也為不同組分多糖在營養(yǎng)保健價值方面的信息提供參考。

多糖是由多個單糖基及糖苷鍵相連接而成的高聚物，一般是10 個以上的單糖聚合而成，其單糖組成復(fù)雜多樣[27]。在色譜圖上能看到除上述9 種單糖以外的未知單糖，例如在11.3 min左右能看到有個明顯的峰；在13.5、17.8 min左右也能看到一個較小的峰，有待后續(xù)進(jìn)一步分析。

[1] 班甲′陳駿佳. 甘蔗固有多糖提取分離及單糖組成分析[J]. 食品科學(xué)′2013′34(20): 182-185. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201320038.

[2] YEN G C DUH P D Antioxidative properties of methanolic extracts from peanut hulls[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society′1993′70(4): 383-386.

[3] 王愛蓉. 紅棗的營養(yǎng)與藥用價值[J]. 科技情報開發(fā)與經(jīng)濟(jì)′2005′15(23): 143-144.

[4] 趙愛玲′李登科′王永康. 棗樹不同品種′發(fā)育時期和器官的水溶性多糖含量研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)′2012′40(10): 1040-1043.

[5] 林勤?！涫Y梅峰. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定大棗低聚糖的單糖組成[J]. 食品科學(xué)′2009′30(16): 210-212.

[6] 樊君′呂磊. 大棗的研究與開發(fā)進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)′2003′24(4): 162-164.

[7] 趙堂′郝鳳霞′楊敏麗. 幾種紅棗中生物活性物質(zhì)環(huán)磷酸腺苷的含量分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)′2011′50(23): 4955-4957.

[8] 耿武松′王雨艨′史學(xué)禮. 不同來源大棗中有效成分蘆丁含量的比較研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐′2012′25(6): 69-71.

[9] 郭英′貝玉祥′王雪梅. 超聲波法提取廣棗多酚的研究[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志′2008′29(8): 36-37.

[10] 胡迎芬. 冬棗黃酮的提取分離及抗氧化′抑瘤活性研究[D]. 青島: 青島大學(xué)′2009.

[11] 樊君′高續(xù)春′郭璞. 大孔吸附樹脂分離純化棗渣中三萜酸的研究[J]. 離子交換與吸附′2008′24(5): 426-433.

[12] 王旭峰′何計國′陳陽. 酸棗仁皂苷的提取及改善睡眠功效的研究[J]. 食品科學(xué)′2006′27(4): 226-228.

[13] 陳紹璦. 植物活性多糖抗癌活性的研究: 抗自由基作用[J]. 中國藥物與臨床′2004′4(8): 606-608.

[14] 李小平. 紅棗多糖提取工藝研究及其生物功能初探[D]. 西安: 陜西師范大學(xué)′2004.

[15] SIVULA N J Research and clinical applications of Ren Shen (ginseng)[J]. American Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine′2012′7(2): 1-4.

[16] 李小平′陳錦屏. 紅棗多糖沉淀特性及抗氧化作用[J]. 食品科學(xué)′2005′26(10): 214-216.

[17] 陳晉芳. 紅棗多糖提取分離純化及其抗氧化性的研究[D]. 晉中: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)′2013.

[18] 丁玉松′王忠. 沙棗多糖抗疲勞作用及其機(jī)制的研究[J]. 食品科學(xué)′2011′32(11): 255-257.

[19] WANG B Chemical characterization and ameliorating effect of polysaccharide from Chinese jujube on intestine oxidative injury by ischemia and reperfusion[J]. International Journal of Biological Macromolecules′2011′48(3): 386-391.

[20] 姜紹通′汪洪普′潘麗軍. 芋頭多糖的分離純化及對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用[J]. 食品科學(xué)′2013′34(19): 287-292. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201319059.

[21] 付海寧′趙峽′于廣利′等. 鹽藻多糖單糖組成分析的四種色譜方法比較[J]. 中國海洋藥物雜志′2008′27(4): 30-34.

[22] 都蕾蕾′張典瑞. 柱前衍生化HPLC法測定黃河灘棗多糖的單糖組成[J]. 中國生化藥物雜志′2012′33(6): 740-743.

[23] 王芝′萬金志. 頭花蓼多糖組分的GC、GC-MS分析[J]. 中國傳統(tǒng)藥物研究和臨床藥理學(xué)′2011′22(4): 458-460

[24] 李奇豫′張貴軍. 桂蠶沙多糖組分的制備與GC-MS分析[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志′2012′18(8): 113-115.

[25] 呂明霞′李媛. 氣相色譜法分析大棗膳食纖維的單糖組成[J]. 中國食品學(xué)報′2012′12(2): 138-140.

[26] 滕利榮′洪水聲. 普魯蘭多糖的粘度性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué)′2003′24(10): 32-35.

[27] 何余堂′潘孝明. 植物多糖的結(jié)構(gòu)與活性研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)′2010′31(17): 493-496.

Analysis of the Monosaccharide Composition of Polysaccharides from “Tangzao” Jujube Fruits a Local Cultivar in Hunan China

SHI Hao WANG Rencai*′PANG Li QIU Zhenhua LIU Jikai
(College of Horticulture and Landscape Hunan Agricultural University Changsha 410128′China)

This study aimed to analyze the monosaccharide composition of five polysaccharides (DTA′DTB1′DTB2′DTB3′and DTC) extracted from “Tangzao” jujube fruits a major local cultivar in Hunan China The polysaccharides were extracted from fruits of three-year-old jujube trees and analysis of the monosaccharide composition was performed by gas chromatography following derivatization with aldononitrile acetate The results showed that the most predominant monosaccharides were glucose xylitol glucose galactose which accou nted for 36.4%′19.4% (as high as 36.4% in DTC)′18.5%′and 24.2% of the total monosaccharides respectively followed by rhamnose ribose arabinoseand mannose which accounted for 7.1%′6.5%′8.1% and 7.9% of the total sugars respectively and then fucose and xylose with relative contents of only 5.0% and 3.4%′respectively (only 0.8% fucose was contained in DTB1and only 0.7% xylose in DTB2). It can be seen that the monosaccharide composition of polysaccharides from “Tangzao” jujubes is quite different.

jujube polysaccharide component monosaccharide

S609.9

A

1002-6630（2015）06-0169-04

10.7506/spkx1002-6630-201506031

2014-07-19

湖南省自然科學(xué)基金委員會與衡陽市政府自然科學(xué)聯(lián)合基金項目（13JJ8010）；湖南省2013年學(xué)位與研究生教育專項資金項目（CX2013B294）

石浩（1988—），男，碩士研究生，研究方向為藥用植物資源高值化利用技術(shù)。E-mail：411863216@qq.com

*通信作者：王仁才（1962—），男，教授，博士，研究方向為藥用植物資源工程。E-mail：409600160@qq.com