張立華，張?jiān)?，孫 蕾，趙登超

（1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；3.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014）

鞣花酸和三萜類物質(zhì)在石榴不同器官中的分布

張立華1，張?jiān)?′*，孫 蕾3，趙登超3

（1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；3.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014）

采用高效液相色譜法分析鞣花酸（ellagic acid，EA）、齊墩果酸（oleanolic acid，OA）和熊果酸（ursolic acid，UA）在棗莊大青皮石榴不同部位的分布規(guī)律。結(jié)果顯示，EA含量：花瓣（5.78 mg/g）＞花托（5.22 mg/g）＞花蕊（4.93 mg/g）＞葉片（3.67 mg/g）＞果皮（2.12 mg/g）；UA含量：花蕊（6.22 mg/g）＞花瓣（5.91 mg/g）＞葉片（2.90 mg/g）＞花托（1.06 mg/g）＞果皮（0.33 mg/g）；OA含量：花瓣（6.62 mg/g）＞花蕊（4.02 mg/g）＞葉片（1.41 mg/g）＞花托（0.79 mg/g）＞果皮（0.28 mg/g）。表明石榴的葉、果皮和花均可作為制取EA和三萜類物質(zhì)的原料，2 類物質(zhì)的含量在石榴花中最高，更具開發(fā)利用前景。

石榴；鞣花酸；熊果酸；齊墩果酸；分布

石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬植物。原產(chǎn)地為中亞地區(qū)，中國(guó)部分地區(qū)有引種。中國(guó)藥典規(guī)定石榴的果皮入藥，其功效為澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲；用于治療久瀉、久痢、便血、脫肛、崩漏、白帶和蟲積腹痛等。除了果皮以外，石榴的其他部位也可作藥用。石榴葉水提取物和石榴果汁具有較強(qiáng)的抗氧化和調(diào)血脂作用[1-2]。石榴花可以用于治療中耳炎[3]，在印度等國(guó)被用于治療糖尿病及其并發(fā)癥[4]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，石榴含有豐富的活性成分，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究，石榴含有多酚、黃酮、生物堿、甾體類以及三萜類化合物等次生代謝物[5]，其中多酚含量較高，據(jù)報(bào)道石榴皮中多酚含量占其干質(zhì)量的10.4%～21.3%[6]，石榴中多酚又包括幾十種化合物[5]，而對(duì)其中鞣花酸（ellagic acid，EA）做了深入研究，EA的分子結(jié)構(gòu)具有多個(gè)酚羥基，能中和自由基，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化活性[7]，以4 g/kg的劑量飼喂小鼠實(shí)驗(yàn)表明EA具有抑制多種腫瘤的作用[8]；三萜類物質(zhì)是另一類重要的藥用成分，主要有熊果酸（ursolic acid，UA）和齊墩果酸（oleanolic acid，OA），二者為同分異構(gòu)體，在分子結(jié)構(gòu)上僅存在一個(gè)甲基位置的不同，UA和OA具有抗突變、抗癌[9]及免疫雙向調(diào)節(jié)作用[10]，能夠作用于胰島的β-細(xì)胞促進(jìn)胰島素的分泌[11]，已作為用于治療惡性腫瘤[12]、肝硬化等疾病臨床藥物[13]。有學(xué)者研究了采摘季節(jié)和品種對(duì)石榴葉中EA含量的影響[14]，其中采摘季節(jié)的影響較為明顯，EA的含量隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加。張立華等[15]研究了石榴葉中多酚、黃酮及生物堿的季節(jié)性變化情況。至今，未見有關(guān)三萜類物質(zhì)及EA在石榴不同器官的分布規(guī)律的報(bào)道。本研究比較了石榴不同器官中EA和三萜類物質(zhì)的含量，為更有效開發(fā)石榴資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品均從棗莊石榴園主栽品種大青皮石榴果樹上采集，其中石榴皮在9月下旬由成熟的石榴果實(shí)剝?nèi)。窕ㄔ?月中下旬采集，石榴葉在9月下旬采集。把采集的材料先在烘箱內(nèi)（105 ℃）殺青處理15 min，然后在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)（80 ℃）干燥至恒質(zhì)量，粉碎后過40 目篩，備用。

EA（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；OA、UA（純度≥98%） 美國(guó)Sigma公司；甲醇（色譜純） 天津市康科德科技有限公司；所用水為重蒸水，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

510型高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；數(shù)顯HH-4恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；JA103型電子分析天平（感量0.01 mg） 上海越平科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 EA含量的分析

參照Lei Fan等[16]的方法，并稍加改動(dòng)。

1.3.2 EA標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

使用JA103型電子分析天平精確稱取EA標(biāo)準(zhǔn)品1.30 mg，用甲醇溶解，定容至1 000 mL，得質(zhì)量濃度為1.3 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.3 EA樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取石榴各樣品粉末0.50 g，加入甲醇溶液30 mL，回流提取60 min，過濾，殘?jiān)?0 mL提取溶劑重復(fù)提取1 次，合并濾液，定容于50 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為Symmetry C18柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相A相為甲醇，B相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%磷酸；梯度洗脫，0～10 min，A相10%→30%，B相 90%→70%；10～40 min，A相30%→100%，B相70%→0%；洗脫液流速1 mL/min；檢測(cè)溫度30 ℃；進(jìn)樣量20 ?L；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.3.5 OA和UA含量的分析

測(cè)定樣品中的OA含量和UA含量參照王岱杰等[17]的方法，并略加改動(dòng)。

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精確稱取OA 3.24 mg和UA 7.81 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其質(zhì)量濃度分別為0.324 mg/mL和0.781 mg/mL。

1.3.5.2 樣品溶液制備

精確稱取各樣品粉末1.00 g，置于具塞錐形瓶中，加無水乙醇30 mL，超聲波處理2 h，過濾，殘?jiān)?0 mL乙醇洗滌2 次，洗滌液并入濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸去乙醇，殘余物用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm濾膜過濾，濾液作為樣品溶液。

1.3.5.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil Cl8柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（88∶12∶0.1，V/V）；檢測(cè)器Waters UV-2487；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；靈敏度0.6 AUFS；流速1 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量10 ?L。外標(biāo)法定量分析，UA和OA分離度為1.95；理論塔板數(shù)均大于13 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 EA含量的測(cè)定

圖1 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of EA standard and leaf extract

圖2 石榴不同器官中EA的含量Fig.2 The contents of EA in different organs of pomegranates

圖1 為EA的液相色譜，EA的保留時(shí)間為23.12 min。石榴各器官EA的含量見圖2，其中花瓣中EA的含量最高，5.78 mg/g，其次是花托＞花蕊＞葉片＞果皮，果皮中含量最低，為2.12 mg/g。Xiang Lan等[14]測(cè)定了11 個(gè)品種石榴葉在7～10月中EA含量在1.30～6.46 mg/g范圍之內(nèi)，本研究所用石榴葉為9月底采集的樣品，EA含量為3.67 mg/g，與文獻(xiàn)[14]中的結(jié)果基本一致。石榴葉和果皮等材料中含有大量的多聚鞣花酸，也叫鞣花單寧[15]，用酸性溶液作提取溶劑，在一定的溫度條件下，可把多聚鞣花酸水解為EA單體[18]。本研究的提取溶劑不含酸，所以所測(cè)定的EA含量是植物材料中存在的游離EA單體。說明石榴的多個(gè)器官部位均可作為提取EA的資源材料或作為生藥資源，尤其是石榴花。

2.2 OA和UA的含量

圖3 OA和UA標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of OA and UA standards and petal extract

圖4 石榴不同器官中OA和UA的含量Fig.4 The contents of OA and UA in different organs of pomegranates

OA和UA的液相色譜如圖3所示，二者的保留時(shí)間分別為19.859 min和20.725 min。不同器官中2 種三萜類物質(zhì)的含量見圖4所示，OA含量最高的部位是花瓣，占干質(zhì)量的6.62 mg/g，其次是花蕊、葉片、花托，果皮中含量最低。UA含量最高的部位是花蕊，6.22 mg/g，其次是花瓣、葉片、花托，果皮中的含量也最低。在葉片和花蕊中UA的含量明顯高于OA，花瓣中OA含量高于UA，在果皮和花托中二者的含量相差不大。三萜類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前不能人工合成，從植物材料中提取是其主要來源，常用的植物材料如女貞子、木瓜、山楂、夏枯草、楤木等，有報(bào)道[19]女貞子中OA的含量約為干質(zhì)量的1%，也有人比較了15 個(gè)品種木瓜中OA和UA的含量，以金寶綠香玉木瓜中的含量最高，兩者質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為0.156 6%[17]。歐洋等[20]測(cè)定了OA和UA在西藏木瓜中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.18%和0.49%。除石榴果皮中2 種萜類成分的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%）比木瓜低之外，其他部位均比木瓜的含量高，因此，石榴的花、葉、果皮都可以作為制取OA和UA的植物材料，尤其石榴花部分。

3 結(jié) 論

采用HPLC法分析了EA、OA和UA在棗莊大青皮石榴不同部位的分布規(guī)律，結(jié)果顯示，EA含量：花瓣（5.78 mg/g）＞花托（5.22 mg/g）＞花蕊（4.93 mg/g）＞葉片（3.67 mg/g）＞果皮（2.12 mg/g）；UA含量：花蕊（6.22 mg/g）＞花瓣（5.91 mg/g）＞葉片（2.90 mg/g）＞花托（1.06 mg/g）＞果皮（0.33 mg/g）；OA含量：花瓣（6.62 mg/g）＞花蕊（4.02 mg/g）＞葉片（1.41 mg/g）＞花托（0.79 mg/g）＞果皮（0.28 mg/g）。表明大青皮石榴的葉、果皮和花均可作為制取EA和三萜類物質(zhì)的原料，2 類物質(zhì)的含量在石榴花中最高，更具開發(fā)利用前景。

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Distribution of Ellagic Acid and Triterpenes in Different Organs of Pomegranate

ZHANG Lihua1′ZHANG Yuanhu2′*′SUN Lei3′ZHAO Dengchao3
(1. College of Life Sciences Zaozhuang University Zaozhuang 277160′China; 2. State Key Laboratory of Crop Biology Shandong Agricultural University Tai’an 271018′China; 3. Shandong Academy of Forestry Jinan 250014′China)

The distribution of ellagic acid (EA)′oleanolic acid (OA and ursolic acid (UA in the petals receptacle stamens leaves and peel of ‘Daqingpi pomegranate in Zaozhuang of Shandong province was studied using high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the content of EA was in the decreasing order of petals (5.78 mg/g) ＞ receptacle (5.22 mg/g) ＞ stamens (4.93 mg/g) ＞ leaves (3.67 mg/g) ＞ peel (2.12 mg/g); for UA the decreasing order was stamens (6.22 mg/g) ＞ petals (5.91 mg/g) ＞ leaves (2.90 mg/g) ＞ receptacle (1.06 mg/g) ＞ peel (0.33 mg/g); and for OA the decreasing order was petals (6.62 mg/g) ＞ stamens (4.02 mg/g) ＞ leaves (1.41 mg/g) ＞ receptacle (0.79 mg/g) ＞ peel (0.28 mg/g). It is suggested that leaves peel and flowers of pomegranate may be used as raw materials for extracting EA and triterpene Especially the flowers have better prospects for development and utilization.

pomegranate ellagic acid ursolic acid oleanolic acid distribution

R297.3

A

1002-6630（2015）06-0136-04

10.7506/spkx1002-6630-201506025

2014-08-11

公益性行業(yè)（林業(yè)）科研專項(xiàng)（201204402）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013BL018）

張立華（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)及采后生理。E-mail：chinazhanglh@163.com

*通信作者：張?jiān)?963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锎紊x及分子調(diào)控。E-mail：yhzhang9@163.com