周思思，王榆元，劉 丹，張一旻，劉思余，王曉晴′*，曾曉雄,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南華大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 衡陽 421001）

超聲波輔助提取人參花多糖工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

周思思1，王榆元2，劉 丹1，張一旻1，劉思余1，王曉晴1′*，曾曉雄1,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南華大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 衡陽 421001）

以干燥人參花為原料提取多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取人參花多糖工藝，并建立回歸模型；同時探究其體外抗氧化活性。結(jié)果表明：超聲波輔助提取人參花多糖的最佳提取工藝為超聲功率586 W、超聲時間18.65 min、料液比1∶19.75（g/mL），在此條件下多糖得率為（5.20±0.17）%（n=3）。超聲提取的人參花多糖具有較高的抗氧化活性，對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除作用明顯，且其質(zhì)量濃度與抗氧化活性呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，是一種良好的天然抗氧化劑。

人參花多糖；超聲波；響應(yīng)面；工藝優(yōu)化；抗氧化

人參（Panax ginseng C.A. Meyer）為五加科人參屬植物，在我國有著悠久的藥用歷史，其中主要活性成分為人參皂苷及人參多糖[1-2]。自古以來，多以根部入藥，對人參的地上部分少見研究[3-5]。有研究表明，人參花富含人參皂苷及其他各種揮發(fā)油等有效成分，人參花皂苷含量比人參高出5 倍以上，因此認(rèn)為人參花的藥用價值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人參根[6-8]。天然的植物多糖具有許多重要的生理活性，如參與生物體的免疫調(diào)節(jié)功能，降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等。近幾年來對植物多糖的結(jié)構(gòu)、提取工藝和生物功能等方面的研究也越來越多，引起了廣泛的關(guān)注[9-10]。目前，對于人參花的研究大多圍繞人參皂苷，對人參花多糖的研究鮮見報道[11-12]。超聲提取技術(shù)是利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、熱學(xué)效應(yīng)及空化等物理化學(xué)效應(yīng)造成被破碎物細(xì)胞壁及整個生物體破裂，從而加速胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解，提高提取得率。與常規(guī)提取法相比，超聲提取法具有提取時間短、產(chǎn)率高、避免高溫對中藥多糖有效成分影響的優(yōu)點(diǎn)，是一種高效實(shí)用的多糖提取方法，并日益被應(yīng)用到多種化合物的提取分離過程[13-16]。

本實(shí)驗(yàn)利用超聲波輔助提取人參花多糖，并通過響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時對人參花多糖體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用人參花的藥用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 a生干燥人參花購買自吉林省長春市撫松縣滋身堂土特產(chǎn)有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazxyl，DPPH）、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、菲洛嗪、氯化硝基四氮唑蘭（nitroblue tetrazolium，NBT） 美國Sigma公司；吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、雙氧水、無水乙醇、抗壞血酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-ⅡD超聲儀 寧波新芝生物科技有限公司；SC-02低速離心機(jī) 蘇州佳培商貿(mào)有限公司；高速離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技有限公司；UV2501紫外分光光度計 日本島津公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮升華儀器廠；ESJ12024型電子天平 洛陽龍騰電子稱量儀器有限公司；RT-6000雷杜酶標(biāo)分析儀 美國雷杜公司。

1.3 方法

1.3.1 人參花多糖的提取

稱取一定量的6 a生干燥人參花，粉碎過100 目篩。超聲提取后，將所得提取液在4 000 r/min條件下離心10 min，上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再加入4 倍體積無水乙醇醇沉過夜。次日離心獲得提取液，用Sevag法除蛋白5 次，收集所得濃縮液流水透析24 h后經(jīng)真空冷凍干燥即獲得多糖。

1.3.2 人參花多糖的超聲提取單因素試驗(yàn)

在其他條件相同的情況下，采用不同超聲功率、超聲時間以及料液比進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，以人參花多糖得率為響應(yīng)值，逐個考察各提取條件對提取效果的影響。1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計因素及水平Table1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、超聲功率、超聲時間為自變量，多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原理，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見表1。以Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行回歸分析，并采用多元回歸分析方法擬合多元二次方程，從而預(yù)測人參花多糖超聲提取的最佳工藝[17-20]。

1.3.4 超聲提取人參花多糖體外抗氧化能力的測定

將超聲提取的多糖凍干樣品分別配制成4 000、2000、1 000、500、250 μg/mL 5 種質(zhì)量濃度。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除活性的測定參照Luo Anxue等[21]報道的方法稍作修改：取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液50 μL于微孔板中，分別加入15 μL DPPH溶液（0.4 mmol/L）以及100 μL水。混勻后避光保存30 min于分光光度計517 nm波長處測吸光度。以VC 作為陽性對照，以水代替多糖溶液、無水乙醇代替DPPH溶液，做空白實(shí)驗(yàn)。按式（1）計算DPPH自由基清除率：

式中：A0為空白對照實(shí)驗(yàn)（水代替多糖溶液）的吸光度；A1為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度；A2為樣品干擾實(shí)驗(yàn)（無水乙醇代替DPPH溶液）的吸光度。

1.3.4.2 超氧陰離子自由基清除能力測定

超氧陰離子自由基清除活性的測定參照Qiao Deliang等[22]報道的方法稍作修改：取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液50 μL于微孔板中，分別加入50 μL NBT溶液（156 μmol/L）、50μL NADH溶液（468 μmol/L）和50 μL PMS溶液（60 μmol/L）?；靹蚝笥?5 ℃水浴5 min，于分光光度計560 nm波長處測吸光度。以水代替多糖溶液、0.2 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液，做空白實(shí)驗(yàn)。按式（2）計算超氧陰離子自由基清除率：

式中：A0為空白對照實(shí)驗(yàn)（水代替多糖溶液）的吸光度；A1為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光度；A2為樣品干擾實(shí)驗(yàn)（0.2 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液）的吸光度。

1.3.4.3 羥自由基清除能力的測定

羥自由基清除活性的測定參照金鳴等[23]報道的方法稍作改進(jìn)：取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液50 μL于微孔板中，分別加入50 μL鄰二氮菲（0.75 mmol/L）、100 μL PBS 緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4）、50 μL FeSO4溶液（0.75 mmol/L）、50 μL 體積分?jǐn)?shù)0.01% H2O2溶液。搖勻后于37 ℃條件下保存30 min，在536 nm波長處檢測吸光度。以VC作為陽性對照。按式（3）計算羥自由基的清除率：

式中：A1為樣品的吸光度；A0為空白對照實(shí)驗(yàn)（水代替多糖溶液）的吸光度；A2為水代替H2O2和多糖的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，利用統(tǒng)計分析處理軟件DPS及Excel程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。采用Design-Expert 8.05b數(shù)據(jù)處理專家進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對多糖提取效果的影響

在料液比1∶20（g/mL）、超聲時間20 min的條件下，研究超聲功率200、400、500、600、700 W對人參花多糖提取效果的影響。

圖1 超聲功率對人參花多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides

由圖1可知，在200～600 W范圍內(nèi)，人參花多糖得率隨著超聲功率的增大而提高，當(dāng)超聲功率為600 W時，多糖得率基本達(dá)到最大值，當(dāng)超聲功率繼續(xù)增大時，多糖得率逐漸下降。原因可能是由于超聲波功率越大，其產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械作用越劇烈，使得分子間運(yùn)動的速率更快，加速粒子間的碰撞及擴(kuò)散程度，使細(xì)胞壁破碎，導(dǎo)致多糖滲透出來的速率加快，但當(dāng)超聲功率達(dá)到一定值時，細(xì)胞內(nèi)人參花多糖含量逐漸減少，造成內(nèi)外滲透壓達(dá)到平衡，使多糖的滲透率降低[24-26]。因此，最佳超聲功率在600 W附近，選取600 W為自變量超聲功率的0水平。

2.1.2 超聲時間對人參花多糖提取效果的影響

在超聲功率600 W、料液比1∶20（g/mL）的條件下，研究超聲時間10、15、20、25、30 min對人參花多糖提取效果的影響。

從圖2可知，當(dāng)超聲時間不超過20 min時，隨著超聲時間的延長，多糖的得率逐漸增大，當(dāng)超聲時間超過20 min后，多糖的得率逐漸降低，這表明人參花多糖的提取過程與時間密切相關(guān)，提取時間較短時，產(chǎn)物不充分溶解；時間過長，大分子多糖在超聲波的強(qiáng)剪切作用下發(fā)生斷裂[27]，在后期處理時出現(xiàn)損失現(xiàn)象，影響提取效果。因此最佳提取時間在20 min附近，選取20 min為自變量提取時間的0水平。

圖2 超聲時間對人參花多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction yield of polysaccharides

2.1.3 料液比對人參花多糖提取效果的影響

在超聲功率600 W、超聲時間20 min的條件下，研究料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）對人參花多糖提取效果的影響。

圖3 料液比對人參花多糖得率的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides

料液比是影響多糖提取效果的一個重要因素，主要影響固相與液相之間的濃度差。由圖3可知，隨著溶劑用量的增加，多糖得率逐漸增大，當(dāng)料液比在1∶20時，多糖得率達(dá)到最大值，隨后再增大溶劑用量，多糖得率隨之降低，故選取1∶20（g/mL）為自變量料液比的0水平。

2.2 響應(yīng)面分析法對人參花多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table2 Eperimental design and result for response surface analysis

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計的原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。

根據(jù)表2結(jié)果，利用Design-Expert 8.05b軟件建立人參花多糖得率（Y）對編碼自變量超聲功率（A）、超聲時間（B）、料液比（C）的二次多項回歸模型：

Y=5.16—0.10A—0.17B—0.074C＋0.065AB—0.17AC＋0.067BC—0.21A2—0.34B2—0.41C2

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.05b軟件對各試驗(yàn)條件下的數(shù)據(jù)結(jié)果（表2）進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到了方差分析結(jié)果，如表3所示。

表3 回歸方程方差分析表Table3 Analysis of variance for the fitted regression equation

回歸方程中各變量對響應(yīng)值（多糖得率）影響的顯著性由F值來判定，概率P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表3可知，總回歸方程F檢驗(yàn)P=0.000 2＜0.01，達(dá)到極顯著水平，并且結(jié)果表明回歸方程失擬檢驗(yàn)P=0.228 4＞0.05，失擬性的檢驗(yàn)結(jié)果不顯著，說明剩余不可忽略因素對試驗(yàn)影響性較小，此方程較好的擬合了試驗(yàn)?？梢杂糜谌藚⒒ǘ嗵浅暦ㄝo助提取試驗(yàn)的理論預(yù)測。此外，A2、B2、C2對多糖得率影響顯著，從F值判斷，各個因素對多糖得率影響次序是：B＞A＞C，即3 個因素中，對多糖得率影響大小的因素依次是：超聲時間＞超聲功率＞料液比，且這3 個因素對多糖得率的影響達(dá)到了顯著水平。

2.2.3 各因素交互作用對多糖得率的響應(yīng)面分析

為考察各個因素交互對人參花多糖得率的影響，在其他因素條件不變的情況下，測定交互項對得率的影響。根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線如圖4所示。

由圖4可知，3 個因素在所選范圍之內(nèi)均能產(chǎn)生最佳響應(yīng)，說明3 個因素的選擇合理有效，能夠很好地反映出3 個因素對響應(yīng)值的影響趨勢。在試驗(yàn)設(shè)定的水平范圍內(nèi)，隨著每個因素取值的增大，響應(yīng)面對應(yīng)值也增大；當(dāng)響應(yīng)面增大到極值后，隨著因素取值的增大，響應(yīng)值逐漸減小。

圖4 各因素交互作用對人參花多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of operating parameters on the extraction rate of polysaccharides

由Design-Expert 8.05b軟件分析出超聲提取人參花多糖的最佳提取條件為超聲功率586 W、超聲時間18.65 min、料液比1∶19.75（g/mL），在此條件下，人參花多糖的得率為（5.20±0.17）%。

2.3 人參花多糖體外抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除活性

圖5 人參花多糖及VC對DPPH自由基的清除活性Fig.5 Comparison of DPPH radical scavenging capacity between ginseng flower polysaccharides and vitamin C

由圖5可知，不同質(zhì)量濃度的樣品對DPPH自由基的清除能力不同，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，對DPPH自由基清除率隨之增加。且VC對DPPH自由基清除率均低于相同質(zhì)量濃度條件下人參花多糖對DPPH自由基的清除率。質(zhì)量濃度超過2 000 μg/mL后，人參花多糖對DPPH自由基的清除能力仍在增加，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到4 000 μg/mL時，DPPH自由基清除率達(dá)到68.29%，已明顯高于相同質(zhì)量濃度條件下VC對DPPH自由基的清除率。

2.3.2 超氧陰離子自由基清除活性

圖6 人參花多糖及VC對超氧陰離子自由基的清除活性Fig.6 Comparison of superoxide anion free radical scavenging capacity between ginseng flower polysaccharides and vitamin C

從圖6可知，人參花多糖具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基的能力，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而逐步提高，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，且當(dāng)質(zhì)量濃度增長到4 000 μg/mL時，人參花多糖對超氧陰離子自由基的清除率高達(dá)73.12%。在相同質(zhì)量濃度條件下，VC對超氧陰離子自由基清除率均高于人參花多糖。

2.3.3 羥自由基清除活性

圖7 人參花多糖及VC對羥自由基的清除活性Fig.7 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity between ginseng flower polysaccharides and vitamin C

從圖7可知，在相同質(zhì)量濃度條件下，VC清除羥自由基活性能力強(qiáng)于人參花多糖的清除能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，清除羥自由基的能力不斷增加。整體來看，VC對羥自由基清除能力要強(qiáng)于人參花多糖。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面軟件優(yōu)化人參花多糖的超聲提取工藝后，得出超聲提取法最佳工藝為超聲功率586 W、超聲時間18.65 min、料液比1∶19.75，人參花多糖得率為5.20%。并得到人參花多糖得率與超聲處理各因素變量的二次方程模型，該模型回歸顯著，對試驗(yàn)擬合程度好，表明人參花多糖的超聲波輔助提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有很高的應(yīng)用價值。超聲波輔助提取可以提高人參花多糖的利用率，降低生產(chǎn)成本，開發(fā)和利用人參花多糖具有良好的應(yīng)用前景，對于工廠的實(shí)際生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義[28-30]。另外，體外抗氧化研究結(jié)果表明，人參花多糖具有較高的抗氧化活性，對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基有清除作用。多糖在生物體內(nèi)的代謝過程較為復(fù)雜，其抗氧化作用可能直接參與自由基的猝滅反應(yīng)，也可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化劑的活性來實(shí)現(xiàn)[31-35]。因此，人參花多糖的體內(nèi)生物功效仍有待進(jìn)一步的研究與探討。

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Ultrasonic-Assisted Extraction of Polysaccharides from Ginseng Flower and Their Antioxidant Activity in vitro

ZHOU Sisi1, WANG Yuyuan2, LIU Dan1, ZHANG Yimin1, LIU Siyu1, WANG Xiaoqing1,*, ZENG Xiaoxiong1,*
(1. College of Food Science and Technology Nanjing Agricultural University Nanjing 210095′China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering Nanhua University Hengyang 421001′China)

Based on single factor experiments, the ultrasonic-assisted extraction process for crude water-soluble polysaccharides (μGFL) from dry ginseng fl ower was optimized with response surface methodology. The in vitro antioxidant activity of polysac charides extracted from ginseng fl ower was determined. The optimal extraction conditions were obtained as follows: ultrasonic power, 586 W; extraction duration, 18.65 min; and material/liquid ratio, 1:19.75. Under these conditions, the extraction yield of polysaccharides from ginseng fl ower was (5.20 ± 0.17)% (n = 3). The ginseng fl ower polysaccharides showed potential scavenging activity against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazxyl (DPPH), hydroxyl and superoxide anionradical in a concentration-dependent manner. This study indicates that ginseng fl ower polysaccharides are a good source of natural antioxidants.

ginseng flower polysaccharides; ultrasonic treatment; response surface methodology; process optimization; antioxidant activities

Q946.3

A

1002-6630（2015）06-0076-06

10.7506/spkx1002-6630-201506014

2014-07-10

江蘇省優(yōu)勢學(xué)科人才引進(jìn)計劃項目（08080900213）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)SRT計劃項目（1318A10）

周思思（1994—），女，本科，研究方向?yàn)樘巧飳W(xué)。E-mail：18211123@njau.edu.cn

*通信作者：王曉晴（1973—），女，講師，博士，研究方向?yàn)樘巧飳W(xué)。E-mail：wangxq@njau.edu.cn 曾曉雄（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zengxx@njau.edu.cn