于艷，陳惠，楊祖福，張念，王文竹，趙立希，白帆，荊瀛黎，李鵬錕

腦卒中患者外周血樹突狀細胞亞型數(shù)量變化的研究①

于艷1,2，陳惠1,2，楊祖福1,2，張念1,2，王文竹2，趙立希2，白帆2，荊瀛黎2，李鵬錕2

目的研究腦卒中患者外周血中樹突狀細胞(DCs)的變化規(guī)律。方法選擇2014年6～9月在北京博愛醫(yī)院神經(jīng)康復科住院的腦梗死患者30例和腦出血患者26例，依據(jù)美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分(NIHSS)標準評價腦卒中的嚴重程度。同時選擇健康體檢者14名作為正常對照組。采用流式細胞技術檢測三組外周血中DCs各亞型的比例。結(jié)果三組間外周血中DCs的數(shù)量無統(tǒng)計學差異，但其亞型的比例具有明顯變化。與對照組相比，腦出血和腦梗死患者骨髓樣樹突狀細胞(mDCs)占外周血樹突狀細胞的比例均顯著減少(P＜0.001)。腦出血患者外周血漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)的比例下降(P＜0.05)，腦梗死患者pDCs比例降低更加顯著(P＜0.001)。根據(jù)NIHSS評分，腦出血和腦梗死患者分別分成NIHSS≤7組和NIHSS＞7組。腦出血和腦梗死患者NIHSS＞7組pDCs的比例均低于NIHSS≤7組(P＜0.05)，但NIHSS＞7組mDCs比例與NIHSS≤7組無顯著性差異。結(jié)論腦卒中患者外周血中DCs亞型的分布比例發(fā)生變化，提示免疫炎癥反應在腦卒中發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

腦卒中；腦梗死；腦出血；骨髓樣樹突狀細；漿細胞樣樹突狀細胞；美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分

[本文著錄格式]于艷，陳惠，楊祖福，等.腦卒中患者外周血樹突狀細胞亞型數(shù)量變化的研究[J].中國康復理論與實踐, 2015,21(6):648-652.

CITED AS:Yu Y,Chen H,Yang ZF,et al.Quantity change of peripheral blood dendritic cells subtypes in patients with stroke[J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(6):648-652.

目前腦血管病嚴重影響著人類健康和生存質(zhì)量，其中腦卒中具有高發(fā)病率、高死亡率、高復發(fā)率和高致殘率的特點。腦卒中病因復雜，研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥反應在其發(fā)生發(fā)展的病理過程中具有重要作用。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的專職抗原呈遞細胞(antigen presentation cell,APC)，作為機體免疫反應的始動者，在特異性細胞免疫和體液免疫中均起十分重要的作用。根據(jù)DCs來源不同將其分為兩大類，即來源于髓系干細胞的髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cells,mDCs)和來源于淋巴系干細胞的漿細胞樣樹突狀細胞(plamacytoid dendritic cells, pDCs)。研究發(fā)現(xiàn)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型中，DCs大量出現(xiàn)在缺血損傷區(qū)[1]。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)腦血管狹窄患者外周血mDCs的比例發(fā)生變化，且mDCs下降的趨勢隨著腦血管狹窄程度加重[2]。這些研究提示，DCs參與腦卒中的發(fā)生發(fā)展。

本研究旨在應用流式細胞技術檢測腦出血和腦梗死患者外周血中DCs數(shù)量的變化，探討DCs與腦卒中及其他臨床指標的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2014年6～9月北京博愛醫(yī)院的腦梗死患者30例，其中男性22例，女性8例；年齡42～76歲，平均年齡58歲。腦出血患者26例，其中男性15例，女性11例；年齡34～68歲，平均年齡50歲。

診斷均符合第四屆全國腦血管病學術會議制定的腦血管病診斷標準[3]，并經(jīng)CT或MRI證實。

對照組14名，來自同期本院體檢正常健康者。其中男性6名，女性8名；年齡35～68歲，平均56歲。排除既往有腦血管疾病、消化道疾病、嚴重感染、惡性腫瘤、營養(yǎng)不良及家族遺傳病史者。

1.2 樣本采集

受試者禁食12 h后，于次日清晨抽取肘靜脈血4 ml加入EDTA抗凝管備用。分別取全血100 μl，分別加入已置入染色劑及試劑(見表1)的流式管中，室溫暗處孵育20 min；加入FACS溶血劑2 ml，混勻后放置10 min，1500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗2次，加PBS 300 μl，上機分析。

表1 相關試劑列表(μl)

1.3 研究方法

采用AriaII流式細胞儀(美國BD公司)進行檢測分析，使用Cell Quest軟件獲取50000個細胞，Cell Quest Plot軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算相應陽性細胞百分數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料和實驗室檢查結(jié)果

各組間性別、年齡、危險因素(吸煙、飲酒)等相比無顯著性差異(P＞0.05)，腦出血患者和腦梗死患者外周血甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、空腹血糖、白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞水平分別與對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)，但腦出血患者和腦梗死患者的高密度脂蛋白水平明顯低于對照組(P＜0.01)。見表2。

2.2 外周血DCs流式細胞結(jié)果

DCs占外周循環(huán)白細胞的比例在三組間無顯著性差異(P＞0.05)。相比對照組，腦出血組和腦梗死組的CD11c+的mDCs比例均顯著低于對照組(P＜0.001)。腦出血組CD123+的pDCs比例明顯低于對照組(P＜0.005)，腦梗死組pDCs比例更低(P＜0.001)。見圖1、表3。

依據(jù)美國國立衛(wèi)生院省級功能缺損評分(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)，腦出血患者NIHSS＞7組pDC占DCs的比例明顯低于NIHSS≤7組(P＜0.05)，mDCs的比例沒有顯著性差異；腦梗死患者NIHSS＞7組pDCs的比例也顯著低于NIHSS≤7組(P＜0.001)，mDCs的比例沒有顯著性差異。見表4。

圖1 流式細胞分析外周血DCs結(jié)果

表2 腦卒中病例和對照組臨床資料和實驗室檢查結(jié)果

表3 DCs、pDCs和mDCs比例在各組間分布的情況(%)

表4 根據(jù)NIHSS評分各組DCs分布比例情況

3 討論

炎癥反應在腦血管病發(fā)病中起重要作用，探索卒中后炎癥級聯(lián)反應的病理機制成為近年的研究熱點。

一般認為，炎癥可通過誘導促凝血狀態(tài)促使腦卒中發(fā)生，也可通過活化動脈硬化斑塊，進一步增加腦卒中風險。目前研究發(fā)現(xiàn)，卒中后血腦屏障損傷和細胞破壞，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)得以與全身免疫系統(tǒng)接觸，從而引發(fā)自身免疫應答，最終導致腦組織、腦血管、循環(huán)血液和淋巴器官一系列炎癥級聯(lián)反應的啟動。在MCAO的腦卒中動物模型中發(fā)現(xiàn)，各種淋巴細胞浸潤到腦部，發(fā)揮其相應的免疫反應[4]。

DCs作為激活幼稚T淋巴細胞最主要的專職抗原呈遞細胞，具有決定T淋巴細胞活化的功能，是機體免疫反應的始動者。CD11c+的DCs被認為是成熟的DCs，mDCs皆為CD11c+的DCs，在炎癥刺激下分泌白介素-12(interleukin-12,IL-12)，誘導幼稚T細胞向Th1細胞分化，產(chǎn)生Th1型免疫應答。而pDCs為CD11c-和CD123+，可產(chǎn)生干擾素α，誘導幼稚T淋巴細胞向產(chǎn)生IL-10的T淋巴細胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生Th2型免疫應答。

當前的研究已明確DCs在動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)中的作用。實驗研究發(fā)現(xiàn)，DCs在AS早期和晚期都有數(shù)量和功能的改變，AS斑塊中DCs聚集增多[5]，不穩(wěn)定斑塊中DCs數(shù)量是穩(wěn)定斑塊的10倍[6]。冠心病患者外周血DCs的數(shù)量和功能也均出現(xiàn)顯著異常，CD11c+的mDCs顯著減少[7]，提示其免疫機制參與AS的發(fā)生和發(fā)展。

動脈粥樣硬化是腦卒中最為重要的危險因素，科學家們也在動物模型中驗證了DCs參與的腦卒中免疫炎癥作用。MCAO模型中，腦缺血區(qū)CD11c+的DCs數(shù)量逐漸增加[8]，抑制DCs功能可減少MCAO小鼠腦梗死區(qū)面積，并提高神經(jīng)功能評分[9]。實驗性腦出血動物模型術后12 h進行DCs的檢測，發(fā)現(xiàn)腦組織中DCs數(shù)量也明顯增加[10]。

動物實驗已經(jīng)證明卒中后DCs可遷徙進入受損腦組織，這種遷徙必將一定程度影響外周血中DCs的分布比例，從而最終導致mDCs和pDCs在外周血分布

比例的變化。本實驗從臨床角度證實腦卒中患者DCs在外周血的分布比例發(fā)生的變化。不論是腦出血，還是腦梗死，外周血中mDCs的比例呈現(xiàn)下降趨勢。本實驗結(jié)果與之前冠心病患者外周血中觀察到的DCs變化趨勢一致。

此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者中外周血pDCs的數(shù)量明顯減少，并且與梗死灶的大小和C反應相關蛋白(C-reactive protein,CRP)水平相關[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者外周血pDCs的比例顯著降低，腦出血患者也呈現(xiàn)同樣的下降趨勢。

NIHSS評分能反映腦卒中神經(jīng)功能障礙的嚴重程度。本研究提示，不論是腦梗死患者還是腦卒中患者，其NIHSS＞7分組的外周血中pDCs比例低于NIHSS組，表明外周血中pDCs的比例水平與腦卒中患者的病情嚴重程度相關，此結(jié)果也與之前的研究相符[11]。

綜上所述，本研究證實，DCs與腦卒中發(fā)病密切相關，腦卒中患者外周血CD123+的pDCs比例顯著下降，其中腦梗死患者pDCs的比例比腦出血組更低，且pDCs比例越低，其病情越嚴重。腦出血和腦梗死患者外周血CD11c+的mDCs的比例均顯著減少。

然而本實驗病例數(shù)不多，DCs的分布比例與NIHSS等臨床指標的相關性尚需要大樣本進行進一步驗證。

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Quantity Change of Peripheral Blood Dendritic Cells Subtypes in Patients with Stroke

YU Yan1,2,CHEN Hui1,2,YANG Zu-fu1,2,ZHANG Nian1,2,WANG Wen-zu2,ZHAO Li-xi2,BAI Fan2,JING Ying-li2,LI Peng-kun2
1.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China;2.China Rehabilitation Research Centre,Beijing 100068,China

Objective To explore the change of proportion of peripheral blood dendritic cells(DCs)in patients with stroke.Methods 56 patients(30 cases of cerebral infarction and 26 cases of cerebral hemorrhage)in Beijing Bo'ai hospital from June to September,2014 and 14 healthy controls were investigated.The severity of stroke was assessed with the National Institutes of Health Stroke Scale(NIHSS).Flow cytometry analysis was employed to detect the proportion of DCs subtypes in the peripheral blood.Results No obvious difference was found in DCs between the stroke patients and the controls.Compared to the control group,the percentages of peripheral blood myeloid dendritic cells(mDCs)decreased in the cerebral hemorrhage and the cerebral infarction subgroups(P＜0.001).The percentages of plasmacytoid dendritic cells(pDCs)reduced significantly in the cerebral hemorrhage and the cerebral infarction subgroups(P＜0.05).The stroke patients were divided into NIHSS≤7 subgroup and NIHSS＞7 subgroup.The percentages of pDCs in the cerebral hemorrhage and the cerebral infarction patients were significantly lower in the NIHSS＞7 subgroup than in the NIHSS≤7 subgroup(P＜0.05).While there was no statistical difference between NIHSS≤7 subgroups and NIHSS＞7 subgroups in the percentages of mDCs in the cerebral hemorrhage and cerebral infarction patients.Conclusion The proportion of DCs subtypes in the peripheral blood in stroke patients changed significantly,indicating inflammation responds play a role in stroke.

stroke;cerebral infarction;cerebral hemorrhage;myeloid dendritic cell;plasmacytoid dendritic cell;National Institutes of Health Stroke Scale

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.06.004

R743.3

A

1006-9771(2015)06-0648-05

2014-11-05

2014-11-17)

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(No.2012CZ-15)。

1.首都醫(yī)科大學康復醫(yī)學院，北京市100068；2.中國康復研究中心，北京市100068。作者簡介：于艷(1981-)，女，漢族，北京市人，博士，助理研究員，主要研究方向：神經(jīng)生物學。