王志東，高 峰

(濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，山東濰坊 261053)

隨著對(duì)胃缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制研究的不斷深入，近年來(lái)一氧化氮(NO)在胃黏膜病變過(guò)程中的作用日益受到關(guān)注［1－2］。蘆丁屬于黃酮類化合物，以往研究表明［3］，蘆丁對(duì)炎癥引起的NO過(guò)量生成具有抑制作用。此外，有資料提示［4］蘆丁對(duì)冷凍—束縛應(yīng)激引起的胃黏膜損傷具有保護(hù)作用。然而，蘆丁對(duì)胃缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以大鼠胃缺血再灌注損傷模型研究蘆丁對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用，用光鏡觀察再灌注損傷后大鼠胃黏膜組織形態(tài)學(xué)的變化，并測(cè)定胃黏膜組織中髓過(guò)氧化物氧化酶 (myeloperoxidase，MPO)活性及胃壁黏液和NO的含量，同時(shí)對(duì)胃黏膜組織中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、總NOS(TNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和結(jié)構(gòu)型 NOS(cNOS)活性進(jìn)行了測(cè)定，以探討蘆丁對(duì)大鼠胃缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 蘆丁:Sigma公司，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水溶解。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)A001－1)、總丙二醛(MOD)測(cè)試盒(批號(hào) A003－1)、一氧化氮(NO)試劑盒(批號(hào) A012)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(批號(hào)A014－1)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒(批號(hào) A044)、蘇木素伊紅 (HE)染色試劑盒(批號(hào)D005－1，D019－1)(均為南京建成生物工程研究所)。其他均為AR級(jí)化學(xué)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 高速勻漿機(jī):上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;751G-可見(jiàn)紫外分光光度計(jì):上海分析儀器廠;IX71光學(xué)顯微鏡:日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 普通級(jí)，♂，SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g(濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)前24 h禁食，自由飲水，室溫 (23±2)℃。將SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、缺血再灌注組、蘆丁高劑量組、蘆丁中劑量組、蘆丁低劑量組。蘆丁用生理鹽水稀釋，給藥組分別灌胃給予3種不同劑量蘆丁 (50、100、200 mg·kg－1)，連續(xù) 5 d，大鼠于末次給藥前24 h禁食，末次給藥后60 min實(shí)施胃缺血再灌注。

1.4 胃黏膜損傷模型制備及胃黏膜損傷指數(shù)測(cè)定采用Zhang等［5］方法，用動(dòng)脈夾夾閉大鼠腹腔動(dòng)脈30 min，再灌注1 h以制備大鼠缺血再灌注(GI/R)損傷模型。大鼠麻醉，打開(kāi)腹腔沿胃大彎處剪開(kāi)，用冰冷的生理鹽水沖洗，在冰盤上展開(kāi)，置方格計(jì)數(shù)板(每一方格面積為1 mm2)，以局限于胃腺上皮的點(diǎn)狀糜爛、潰瘍和出血灶的長(zhǎng)度累計(jì)積分:正常為0分，損傷≤1 mm計(jì)1分，≤2 mm計(jì)2分，其余類推;損傷寬度超過(guò)1 mm時(shí)加倍積分，每組大鼠損傷指數(shù)的平均值作為改組胃黏膜損傷指數(shù) (gastric mucosal damage index，GMDI)。

1.5 蘇木素—伊紅染色觀察胃黏膜的損傷 測(cè)量完損傷指數(shù)的胃，于冰盤上剪開(kāi)，一半腺胃置于－80℃保存待用;一半腺胃置于4%多聚甲醛中固定后，乙醇脫水后用石蠟包埋，5μm切片，HE染色，于顯微鏡下觀察病理改變。采用雙盲法，在O-lympus光學(xué)顯微鏡下觀察胃組織形態(tài)學(xué)變化。

1.6 生化指標(biāo)的檢測(cè) 取胃黏膜于冷生理鹽水中勻漿，按試劑盒方法進(jìn)行操作，檢測(cè)SOD、cNOS、iNOS、TNOS、MPO活性及MDA含量。

1.7 胃壁黏液測(cè)定 按Bolton等［6］的阿利新藍(lán)法測(cè)定胃壁結(jié)合黏液。大鼠缺血再灌注后，取胃，沿胃大彎剪開(kāi)后將胃黏膜外翻，浸入阿利新藍(lán)中室溫放置2 h將胃取出，染液離心后，取上清液在751G－可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)上于650 nm波長(zhǎng)條件下比色，計(jì)算染料結(jié)合量。

2 結(jié)果

2.1 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注胃黏膜損傷的影響肉眼觀察顯示:假手術(shù)組動(dòng)物胃黏膜完好;而缺血再灌注組動(dòng)物胃黏膜損傷嚴(yán)重，可見(jiàn)點(diǎn)狀、條索狀和片狀缺損，即潰瘍形成，潰瘍面有出血現(xiàn)象，胃黏膜損傷指數(shù)明顯高于對(duì)照組 (P＜0.001);與缺血再灌注組相比，蘆丁低、中、高劑量組動(dòng)物的胃黏膜損傷均明顯減輕(P ＜0.001或P ＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注胃黏膜損傷的影響(±s n=8)

表1 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注胃黏膜損傷的影響(±s n=8)

注:＊＊＊P ＜ 0.001，vs假手術(shù)組;##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1胃黏膜損傷指數(shù)假手術(shù)組 —2.2 ± 2.1缺血再灌注組 — 132.1 ± 31.3＊＊＊蘆丁低劑量組 50 76.9 ± 11.6##蘆丁中劑量組 100 43.7 ± 23.4###蘆丁高劑量組 200 12.1 ± 8.3###

2.2 HE染色 假手術(shù)組胃黏膜未發(fā)現(xiàn)有病理學(xué)變化(圖1A);顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組胃黏膜有胃黏膜糜爛、出血，局部腺體結(jié)構(gòu)紊亂，間隙擴(kuò)大，并有局部胃黏膜細(xì)胞脫落(圖1B);蘆丁高劑量組上皮基本完整、連續(xù)，腺體排列較整齊;胃黏膜充血較輕微(圖1C)。

2.3 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影響 如表2所示，缺血再灌注組在缺血再灌注后，胃黏膜組織中MDA和NO的含量較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.001);SOD活力降低顯著(P＜0.001)。與缺血再灌注組比較，蘆丁低、中、高劑量組顯著降低受損胃黏膜組織中的MDA和NO的含量，同時(shí)顯著升高其SOD活力，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影響(±s，n=8)

表2 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影響(±s，n=8)

注:＊＊＊P ＜ 0.001，vs假手術(shù)組;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1 SOD/U·mg－1 NO/μmol·g－1 MDA/nmol·(mg prot)－1假手術(shù)組 —167.30 ± 31.35 3.87 ± 1.08 2.50 ± 0.77缺血再灌注組 — 106.20 ± 29.63＊＊＊ 6.64 ± 1.73＊＊＊ 6.31 ± 1.62＊＊＊蘆丁低劑量組 50 126.47 ± 29.02 5.25 ± 1.19# 4.72 ± 1.11#蘆丁中劑量組 100 143.64 ± 29.61# 4.82 ± 1.21## 3.68 ± 1.03##蘆丁高劑量組 200 153.50 ± 24.59## 4.23 ± 0.87## 2.91 ± 1.54###

2.4 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影響 缺血再灌注組大鼠缺血再灌注后，胃黏膜組織中MPO活性較假手術(shù)組顯著升高(P＜0.001)。與缺血再灌注組相比較，蘆丁低、中、高劑量組明顯地降低了大鼠胃黏膜組織MPO活性(P＜0.001)，見(jiàn)表3。

表3 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影響(±s，n=8)

表3 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影響(±s，n=8)

注:＊＊＊P ＜ 0.001，vs假手術(shù)組;###P ＜ 0.001，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1 MPO/U·g －1假手術(shù)組 —2.73 ± 0.57缺血再灌注組 — 6.64 ± 1.38＊＊＊蘆丁低劑量組 50 3.31 ± 1.23###蘆丁中劑量組 100 2.93 ± 0.65###蘆丁高劑量組 200 2.21 ± 0.62###

2.5 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜組織NOS活性的影響 缺血再灌注組大鼠胃黏膜組織TNOS及iNOS活性明顯高于假手術(shù)組(P＜0.001)，cNOS活性明顯低于假手術(shù)組(P＜0.05)。缺血前給予蘆丁明顯降低了TNOS活性和iNOS活性，并顯著地增加了cNOS活性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜組織NOS活性的影響(±s，n=8)

表4 蘆丁對(duì)大鼠缺血再灌注后胃黏膜組織NOS活性的影響(±s，n=8)

注:*P ＜ 0.05，＊＊＊ P ＜ 0.001，vs假手術(shù)組;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1 TNOS活性/U·mg－1 iNOS活性/U·mg－1 cNOS活性/U·mg －1假手術(shù)組 —2.53 ± 0.62 0.06 ± 0.02 2.47 ± 0.58缺血再灌注組 — 4.99 ± 1.11＊＊＊ 3.25 ± 1.95＊＊＊ 1.53 ± 0.52*蘆丁低劑量組 50 3.89 ± 0.51## 1.74 ± 0.52### 2.29 ± 0.52#蘆丁中劑量組 100 3.42 ± 0.55### 0.93 ± 0.71### 2.54 ± 0.55#蘆丁高劑量組 200 2.89 ± 0.72### 0.53 ± 0.33### 2.45 ± 0.77#

2.6 蘆丁對(duì)胃黏液分泌的影響 與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組胃壁黏液結(jié)合量明顯降低;與缺血再灌注組比較，蘆丁高劑量組胃壁黏液結(jié)合量明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 蘆丁對(duì)胃黏液分泌的影響(±s，n=8)

表5 蘆丁對(duì)胃黏液分泌的影響(±s，n=8)

注:＊＊ P ＜ 0.01，vs假手術(shù)組;#P ＜ 0.05，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1胃黏液/mg假手術(shù)組 —3.27 ± 0.79缺血再灌注組 — 1.92 ±0.98＊＊蘆丁低劑量組 50 2.08 ± 0.64蘆丁中劑量組 100 2.49 ± 0.82蘆丁高劑量組 200 2.93 ± 0.95#

3 討論

缺血再灌注損傷特別是胃缺血再灌注損傷，是各種術(shù)后并發(fā)癥、合并癥的首要誘因，嚴(yán)重威脅了人類的健康。NO是由以L-精氨酸為底物在一氧化氮合酶(NOS)的催化下生成的一種重要的生物活性物質(zhì)。研究證明，NOS在胃腸道廣泛存在，根據(jù)NOS來(lái)源和對(duì)鈣、鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)依賴性的不同以及是否受內(nèi)毒素、細(xì)胞因子誘導(dǎo)等特點(diǎn)，NOS分為組成型NOS(constitutive NOS，cNOS)和iNOS近年來(lái)，cNOS又分為神經(jīng)型nNOS和 eNOS(endothelial NOS，eNOS)。

多年來(lái)研究認(rèn)為，NO是一種重要的胃黏膜保護(hù)因子，文獻(xiàn)報(bào)道其胃黏膜保護(hù)活性與其增加胃黏膜血流量有關(guān)［7］。然而，近年研究［2，8］顯示 NO 在胃GI/R時(shí)具有雙重功能，既有胃黏膜保護(hù)作用又有細(xì)胞毒作用。Gou等［1］研究發(fā)現(xiàn)大鼠胃缺血再灌注時(shí)胃黏膜組織中NO含量明顯增高，并發(fā)現(xiàn)缺血再灌注導(dǎo)致NO水平增加是由于胃黏膜組織中iNOS活性增高，造成NO水平快速升高，此時(shí)過(guò)度表達(dá)的NO可直接引起細(xì)胞毒作用或通過(guò)自由基氧化生成毒性更大的強(qiáng)氧化劑，從而導(dǎo)致能量代謝障礙使細(xì)胞死亡。因此，以NO的代謝為治療靶點(diǎn)，尋找療效更好的胃黏膜損傷治療藥物，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

已有文獻(xiàn)報(bào)道［3］，蘆丁具有減輕冷凍—束縛應(yīng)激引起的胃黏膜損傷效應(yīng)［4］，且胃黏膜保護(hù)作用與其抗氧化應(yīng)激活性有關(guān)。研究表明［3］，蘆丁對(duì)炎癥引起的NO過(guò)量生成具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆丁預(yù)處理可以降低大鼠GI/R損傷，抑制胃黏膜中TNOS和iNOS的活性增加，增加cNOS活性，降低胃黏膜組織MDA和NO含量;同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)蘆丁降低了胃黏膜組織中MPO活性，減少淋巴細(xì)胞對(duì)胃黏膜組織浸潤(rùn)，減輕胃黏膜損傷。由此推斷，蘆丁可以抑制大鼠GI/R引起的胃黏膜組織氧化應(yīng)激。此外，本研究表明，蘆丁可通過(guò)抑制胃黏膜TNOS和iNOS的活性增加，上調(diào)cNOS活性調(diào)節(jié)NO的生成，進(jìn)而抑制淋巴細(xì)胞在胃黏膜組織中浸潤(rùn)，發(fā)揮胃黏膜損傷治療作用。

有資料表明［9］，胃黏液分泌減少也是胃缺血再灌注導(dǎo)致胃黏膜損傷的一個(gè)重要誘因。胃黏液系胃黏膜表面覆蓋著的一層具有黏彈性和水不溶性的黏液凝膠，其主要成分為高分子量的黏蛋白，而cNOS來(lái)源的NO可調(diào)節(jié)黏液細(xì)胞的功能，促進(jìn)胃黏液的分泌［10］。本文對(duì)胃壁黏液的含量也進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組胃壁黏液較正常對(duì)照組含量有顯著減少，這與以前的報(bào)道相一致［10］;而蘆丁可以顯著增加胃黏液的含量，以增強(qiáng)潤(rùn)滑與保護(hù)胃黏膜免遭機(jī)械損傷的作用;同時(shí)，由于該黏液的黏滯性，使H+在黏液中的擴(kuò)散速度減慢，從而加強(qiáng)屏障作用。此外，蘆丁可以上調(diào)胃黏膜組織cNOS活性。本文推測(cè)，蘆丁增加胃黏液的含量可能與上調(diào)胃黏膜中cNOS活性，以致cNOS來(lái)源的NO的生成增加，進(jìn)而導(dǎo)致促進(jìn)胃黏液的合成與分泌。然而其具體機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，蘆丁對(duì)大鼠GI/R損傷胃黏膜具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用的機(jī)制調(diào)節(jié)胃黏膜組織中cNOS/iNOS的活性，調(diào)節(jié)NO的生成，從而減輕淋巴細(xì)胞組織浸潤(rùn)和促進(jìn)胃壁黏液分泌有關(guān)。

［1］Gou LS，Zhang L，Yin C，et al.Protective effect of L－ citrulline against acute gastric mucosal lesions induced by ischemia－reperfusion in rats［J］.Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，2011，89(5):317－327.

［2］Kobata A，Kotani T，Komatsu Y，et al.Dual action of nitric oxide in the pathogenesis of ischemia/reperfusion－induced mucosal injury in mouse stomach［J］.Degestion，2007，75(4):188－197.

［3］Guruvayoorppan C，Kuttan G.Rutin inhibits nitric oxide and tumor necrosis factor－alpha produ－ction in lipopolysaccharide and concanavalin－a stimulated macrophages［J］.Drug Metabol Drug Interact，2007，22(4):263－278.

［4］Zhao WZ，Wang YL，Chen ZW，et al.Study on protective effects of rutoside on gastric mucosa in rats［J］.Acta Universities Medicinalis Anhui，1998，33(2):93－ 95.

［5］Zhang JF，Zhang YM，Yan CD，et al.Protective effects of paraventricular nucleus stimulation and vasopression on gastric ischemiareperfusion injury in rats［J］.Acta Physiologica Sinica，2002，54(2):133－138.

［6］Bolton JP，Palmer D，Cohen MM.Stimulation of mucus and nonparietal cell secretion by the E2prostaglandins［J］.Am J Dig Dis，1978，23(4):359－364.

［7］Andrews FJ，Malcontenti－ Wilson C，O’Brien PE.Protection against gastric ischemia－reperfusion injury by nitric oxide generators［J］.Dig Dis Sci，1994，39(2):366－ 373.

［8］Gou L，Zhang L，Yin C，et al.Protective effect of L－ citrulline against acute gastric mucosal lesions induced by ischemia－reperfusion in rats［J］.Can J Physiol Pharmacol，2011，89(5):317－327.

［9］Kim HY，Kim KH.Role of nitric oxide and mucus in ischemia/reperfusion－induced gastric mucosal injury in rats［J］.Pharmacology，2001，62(4):200－207.

［10］Nishida K，Ohta Y，Ishiguro I.Preventive effect of teprenone on stress－induced gastric mucosal lesions and its relation to gastric mucosal constitutive nitric oxide synthase activity［J］.Phar－ macological Research，1999，39(4):325－332.