華 慧，李 增

(蕪湖市第一人民醫(yī)院藥劑科，安徽蕪湖 241000)

血管生成是指在已經(jīng)形成的血管結構基礎上通過芽生或套疊式的方式生成新的血管過程，是一種動態(tài)而又協(xié)調的復雜過程。這一過程主要包括血管內皮細胞、基質細胞的增殖、遷移、分化，及后續(xù)的血管管腔化，整個血管生成的動態(tài)過程中受到多種血管生成因子和血管生成抑制因子的聯(lián)合調控［1］。而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，新生血管能夠為腫瘤生長提供必需的養(yǎng)料，構成腫瘤生長的物質基礎，并為腫瘤浸潤、轉移和擴散提供必備的條件［2－4］。因此，目前臨床上，通過抑制腫瘤血管生成，從而進一步抑制腫瘤生長、擴散與轉移，目前已成為轉移性腫瘤治療的一個重要的策略。Folkman［1］針對性地提出了抗血管增生藥物作用的3種機制:(1)能阻斷血管生成因子的表達、產(chǎn)生或輸出，從而抑制血管基因表型的啟動;(2)當血管生成因子已被吞噬細胞、腫瘤細胞或細胞外基質釋放后，能立即予以滅活，如通過抗體與bFGF的相互作用使其滅活;(3)防止血管內皮細胞增殖和遷移，使內皮細胞對血管生成因子的刺激喪失應答能力［5］。根據(jù)這3種機制，以及血管生成的各個信號調控環(huán)節(jié)及其發(fā)生過程中的生化改變?yōu)榘悬c，現(xiàn)代的血管生成抑制劑的研究主要有如下5種策略:(1)阻斷血管生成因子的表達;(2)阻斷內皮細胞降解周圍基質的能力;(3)直接抑制內皮細胞的功能;(4)阻斷血管生成因子的合成和釋放，拮抗其作用;(5)阻斷內皮細胞表面整合素的作用［6－9］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，新生血管小分子抑制劑具有以下結構特征［10－12］:(1)有兩個芳香基團;(2)其中一個芳香基團上有一個或者多個可以形成氫鍵的受體;(3)兩個芳香基團有一個linker鍵連接。蕓香寧堿(Graveolinine)(結構如圖1所示)結構則符合上述特征。蕓香寧堿屬于2-苯基喹啉類化合物，廣泛存在蕓香科植物中。研究表明，蕓香寧堿有解除平滑肌痊攣的作用(以氯化鋇引起離體兔回腸的痙攣)，有抗炎癥作用(MIC=16 mg·L－1)及抗組胺作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)此類化合物具有抑制腫瘤細胞增殖的作用［13］。但這一類化合物對新生血管生成的抑制作用及這一作用于它的抗腫瘤作用是否有關目前尚不清楚。因此在抑制腫瘤細胞增殖的作用的基礎上，本研究通過以下幾個方面綜合評價了蕓香寧堿的抗血管形成作用:(1)用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和腫瘤細胞進行細胞毒實驗(MTT比色法)，測試藥物對細胞增殖的抑制作用和確定給藥劑量;(2)采用體外內皮細胞遷移、黏附實驗模型，體內動物模型——雞胚絨毛尿囊膜法(CAM法)測試藥物對活體血管增生的抑制作用;(3)蕓香寧堿在非凋亡劑量時對腫瘤細胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白分泌量的影響［14］。

1 材料與方法

1.1 材料 蕓香寧堿 (批號:MFCD00102193)購自阿法埃莎中國化學有限公司;受精雞蛋購自蕪湖市鐘氏禽業(yè)有限責任公司;臍靜脈內皮細胞、人肺癌A549細胞株、人肝癌HepG2細胞株、人腸癌Lovo細胞株、人胃癌MKN-28細胞株、人乳癌MCF-7細胞株作為實驗細胞株購于中山大學動物實驗中心細胞庫;四甲基偶氮唑鹽(批號:206－069－5)購自阿拉丁試劑有限公司;VEGF－ELISA試劑盒(批號:kt039832)購自康肽生物(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞增殖抑制試驗(MTT比色法) 于對數(shù)生長期的人臍靜脈內皮細胞和腫瘤細胞接種于96孔板中，接種密度約為每孔5 000個細胞。接種24 h后。將化合物(初始濃度為10 mmol·L－1)用培養(yǎng)基分別稀釋至100、50、10、1 μmol·L－1。吸去 96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加藥100μL，各濃度平行設三個孔，并設空白孔(不加MTT顯色)和對照孔(不加藥物)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后在每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μL，37℃ 繼續(xù)培育4 h后，棄上培養(yǎng)基，每孔加入100μL DMSO，混勻振蕩15 s使甲臢充分溶解。最后用酶標儀在492 nm處測定各孔OD值，記錄結果。以細胞存活率對劑量作圖求IC50值［15］。

結果計算:細胞存活率=(試驗組細胞OD值－空白組細胞OD值)/(對照組細胞OD值－空白組細胞OD值)×100%。細胞抑制率=(1－細胞存活率)×100%。半數(shù)抑制濃度(IC50)即細胞抑制率為50%時藥物的濃度。用藥物的濃度為橫坐標，細胞抑制率為縱坐標作圖，可求出IC50值。

1.2.2 細胞遷移實驗(刮除法) 參照洪敏等［16］的方法，HUEVCs長滿單層后，0.25%的胰酶消化，調整細胞濃度為每毫升105個，在48孔細胞培養(yǎng)板加入內皮細胞2×104個，置于37℃、含有5%CO2的溫箱中培養(yǎng)。細胞長滿單層后，用滅菌后的移液槍槍頭刮去一條直線。棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，每次100μL。將各化合物(初始濃度為10 mmol·L－1)用 DMEM 分別稀釋至 30、15 μmol·L－1。每孔加藥200μL，各濃度平行設三個孔。同時設置三個對照孔(即不加藥物)，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次。10倍倒置顯微鏡下拍照，計算內皮細胞由刮除邊緣細胞向刮除區(qū)遷移到距離。

1.2.3 細胞黏附實驗 鼠尾膠原蛋白 I型5 g·L－1用 0.006 mol·mL－1的無菌醋酸溶液稀釋至0.012 g·L－1。取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加50 μL鼠尾膠原蛋白溶液(含2μg膠原蛋白)，并設空白(不加膠原蛋白)，超凈臺過夜晾干，用PBS洗3次后每孔加入0.2%的胎牛血清PBS溶液，放置37℃培養(yǎng)箱2 h以阻斷非特異性結合位點。培養(yǎng)后，用PBS洗3次。每孔加入內皮細胞懸浮液50μL，同時加入50μL不同含濃度的化合物的培養(yǎng)基，設置陰性對照(加不含化合物的培養(yǎng)基50μL)，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)分別培養(yǎng)1 h和3 h。培養(yǎng)完畢后，PBS洗3次，除去未黏附細胞。黏附細胞用0.2%結晶紫染色10 min，沖洗，晾干。隨后每孔加入2%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液，在酶標儀570 nm測光密度OD值。每孔平行三次［17］。

結果計算:黏附率=(加化合物細胞OD值－空白組細胞OD值)/(陰性對照組細胞OD值－空白組細胞OD值)×100%，抑制率=(1－黏附率)×100%。

1.2.4 CAM 血管生成形態(tài)學檢測 參考文獻［18－19］所報道的方法制備CAM模型。具體方法:在孵化9 d的雞胚氣室端開一個1 cm×1 cm大小的正方形窗，暴露出尿囊膜，隨后將已制備好的含30 g蕓香寧堿的小紙片(5 mm)放在絨毛尿囊膜血管較少的部位，用滅菌透明膠帶封窗后繼續(xù)孵化。孵育3 d后將雞蛋放入4℃冰箱凍存24 h。將凍存過的雞蛋打在10 cm直徑的細胞培養(yǎng)平皿，剝離CAM膜，以加藥濾紙片為中心，剪取直徑3 cm CAM，平鋪于干凈培養(yǎng)皿中，用數(shù)碼相機拍照。照相后，用固定液(甲醇∶丙酮，1∶1)固定30 min以上，烘干保存。

1.2.5 人肝癌HepG2細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量測定 HepG2細胞設3個復孔接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后分別加入濃度分別為0、4、10、20μmol·L－1的蕓香寧堿，隨后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別收集各組上清液，按照VEGF-ELISA試劑盒操作要求操作，使用酶標儀在450 nm波長處測定樣本的OD值。繪制標準曲線，計算上細胞上清液中VEGF的含量［20］。

2 實驗結果

2.1 蕓香寧堿對HUVEC細胞具有良好生的抑制作用 所有結果均重復3次，得出蕓香寧堿對HUVEC、人肺癌A549細胞、人肝癌HepG2細胞、人腸癌Lovo細胞、人胃癌MKN-28細胞、人乳癌MCF-7細胞的半數(shù)抑制劑量分別為(33.2 ±0.4)、(93.8 ±0.1)、(41.6 ±0.3)、(50.8 ± 0.3)、(72.4 ± 0.5)μmol·L－1和 ＞100 μmol·L－1，說明蕓香寧堿具有優(yōu)先的抑制血管內皮細胞增殖的作用。同時證明蕓香寧堿對于腫瘤細胞的增殖有一定的抑制能力。

2.2 蕓香寧堿衍生物對內皮細胞遷移的抑制作用內皮細胞遷移功能在血管新生、傷口愈合、內皮損傷的愈合等過程中起著重要的作用。內皮細胞在長滿單層在刮出一部分之后，刮出邊緣的細胞將向刮除區(qū)遷移。實驗中不同濃度的蕓香寧堿與內皮細胞共同培養(yǎng)12 h后，內皮細胞向刮除區(qū)的遷移率明顯與化合物濃度呈反比。15μmol·L－1和30 μmol·L－1時，蕓香寧堿對內皮細胞的遷移如圖2所示。在15 μmol·L－1和 30 μmol·L－1時遷移率分別為46.8%和27.4%。具有顯著的內皮細胞遷移抑制作用。

2.3 蕓香寧堿對內皮細胞細胞外基質黏附的抑制作用 蕓香寧堿在與細胞共同作用1 h和3 h時能夠有效的抑制內皮細胞在細胞外基質膠原蛋白上的黏附。當化合物濃度為15μmol·L－1和30μmol·L－1時的抑制率分別為41.7%和52.6%。

2.4 蕓香寧堿對雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用

蕓香寧堿作用9日齡雞胚尿囊膜72 h后，化合物均能不同程度的抑制雞胚尿囊膜上血管生成。如圖3所示，空白對照組的血管網(wǎng)分布均勻、粗大、形成多級分叉，而蕓香寧堿組(30μg)在載樣濾紙片周圍血管網(wǎng)分布稀少、分叉程度較低，與沙利度胺組載體周圍血管生長狀態(tài)相似，顯示出蕓香寧堿經(jīng)過載樣濾紙片的緩慢釋放后，形成了一個強烈抑制CAM血管生成的作用圈。另外，測試物濾紙片周圍血管顏色鮮紅，含血液，說明測試物沒有毒死原有的血管，而是抑制了血管的新生。顯示各蕓香寧堿在30μg下即能顯著抑制CAM血管的生成。

2.5 蕓香寧堿抑制人肝癌HepG2細胞VEGF蛋白分泌 不同劑量蕓香寧堿作用HepG2細胞24 h，測得 0、5、15、30 μmol·L－1各組培養(yǎng)上清液中VEGF 蛋白的含量分別為(401.3 ±21.7)、(354.2 ±24.1)、(309.7 ± 23.5)、(257.4 ± 20.3)μg·L－1。其中15 μmol·L－1和30 μmol·L－1劑量時培養(yǎng)上清液中的 VEGF含量分別比對照組下降22.8%和35.8%，分別P ＜0.05 和 P ＜0.01，差異具有顯著性。

3 討論

以通過抑制腫瘤血管新生而達到抑制腫瘤生長、擴散、浸潤及轉移的策略是近年腫瘤學領域研究的熱點。目前對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展最主流的觀點是癌基因激活、抑癌癥基因失活、腫瘤新血管生成共同作用的結果。而血管生成是腫瘤生長和轉移的條件，因為腫瘤的生長必須依靠新生血管提供氧氣和養(yǎng)料。因此對于腫瘤新生血管有效的阻斷作用既可以抑制腫瘤的生長又可以抑制腫瘤的轉移。在早期，傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物研究主要在腫瘤細胞生長的調控領域尋找作用靶點，因為組織細胞間的相似性使得這類抗腫瘤藥物出現(xiàn)了選擇性差、毒副作用大、耐藥性易產(chǎn)生等缺點。因而結合傳統(tǒng)的放療、化療治療方法，通過抑制腫瘤新生血管生成可以減少傳統(tǒng)藥物的不良作用。故抑制血管生成可以作為抗腫瘤藥物治療新的靶點，具有成為癌癥治療的一個新的突破點的條件［2－4］。

本研究以血管生成作為靶點，在研究中我們發(fā)現(xiàn)蕓香寧堿在高劑量時直接誘導腫瘤細胞的衰老凋亡，而在較低的非凋亡劑量時，能夠優(yōu)先抑制HUVEC的增殖、遷移和黏附作用，同時能夠抑制腫瘤細胞分泌VEGF血管生長因子，從而表現(xiàn)出良好的抗血管生成作用。因此，蕓香寧堿具備成為腫瘤血管新生抑制劑的幾個條件:其一，差異細胞毒性，其殺傷或抑制HUVEC的藥物劑量低于對腫瘤細胞的毒性劑量;其二，擾亂HUVEC的功能作用，即藥物應該是在尚未引起內皮細胞死亡的情況下能夠干擾內皮細胞的功能;其三，初步明確的抗血管生成的作用機制，我們的這一研究已初步明確了蕓香寧堿抗血管生成的基本過程。因此，我們認為，蕓香寧堿在體外具有明顯抗血管生成效應。故本研究為蕓香寧堿的作用機制為抗腫瘤藥物的研發(fā)開啟了一個新的視野，但在研究過程中仍有很多不清楚的因素，需要進一步深入的探討。

［1］Folkman J.Angiogenesis in cancer，vascular，rheumatoid and other disease［J］.Nat Med，1995，1(1):27－31.

［2］Squadrito ML，Palma MD，Michele DP.Macrophage regulation of tumor angiogenesis:Implication for cancer therapy［J］.Mol Aspects Med，2011，32(2):123－145.

［3］龔曉燕，保永亮，黃金玲.血管內皮生長因子與腫瘤侵襲轉移［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(1):8－10.

［4］吳 曄，王震俠.肝細胞癌血管生成及抗血管生成治療的研究進展［J］.肝膽胰外科雜志，2014，26(1):78－82.

［5］Aragon－Ching JB，Madan RA，Dahut WL.Angiogenesis inhibition in prostate cancer:current uses and future promises［J］.J Oncol，2010，2010:361836.

［6］Qin L，Bromberg－ White JL，Qian CN.Opportunities and challenges in tumor angiogenesis research:back and forth between benchand bed［J］.Adv Cancer Res，2012，113:191－239.

［7］Linkous AG，Yazlovitskaya EM.Novel therapeutic approaches for targeting tumor Angiogenesis［J］.Anticancer Res，2012，32(1):1－12.

［8］Lin J，Yan XJ，Chen HM.Fascaplysin，a selective CDK4 inhibitor，exhibit anti－ angiogenic activity in vitro and in vivo［J］.Cancer Chemother Phmarmacol，2007，59(4):439－445.

［9］Zhang X，Lawler J.Thrombospondin－ based antiangiogenic therapy［J］.Mirovasc Res，2007，74(2/3):90－99.

［10］Zhong H，Bowen JP.Antiangiogenesis drug design:multiple pathways targeting tumor Vascula ture［J］.Curr Med Chem，2006，13(8):849－862.

［11］陳 嬌，徐為人.抗腫瘤血管新藥的研究進展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2012，27(1):1－5.

［12］郭曉川，張婷婷，蘇 丹，等.抗腫瘤血管生成藥物及血管生成相關因子的研究進展［J］.腫瘤防治研究，2013，40(10):1001－1006.

［13］Oliva A，Meepagala KM，Wedge DE，et al.Natural fungicides from Ruta graveolens L.leaves，including a new quinolone alkaloid［J］.J Agric Food Chem，2003，51(4):890－896.

［14］Matsumoto G，Hirohata R，Hayashi K，et al.Control of angiogenesis by VEGF and endostatin－encapsulated protein microcrystals and inhibition of tumor angiogenesis［J］.Biomaterials，2014，35(4):1326－1333.

［15］李鵬翀，趙博新，梁倩瑩，等.MTT法檢測非小細胞肺癌對紫杉醇的敏感性［J］.藥學研究，2014，33(1):1－4.

［16］洪 敏，唐小卿，何 葵.硫化氫對人結腸癌細胞增殖和遷移的影響［J］.南方醫(yī)科大學學報，2014，34(5):699－703.

［17］Isaacs JT，Pili R，Qian DZ，et al.Identification of ABR－215050 as lead second generation quinoline-3-carboxamide anti-angiogenic agent for the treatment of prostate cancer［J］.Prostate，2006，66(16):1768－1778.

［18］陳 蓉，王佑華 聶穎穎，等.雞胚絨毛尿囊膜技術應用體會［J］.安徽醫(yī)藥，2005，9(12):950.

［19］Domenico R.The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology［J］.Experimental Cell Research，2014，328(2):314－324.

［20］葉松山，楊 雷，毛秉豫，等.丹參提取物對大鼠心肌梗塞后心肌組織VEGF表達的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，25(5):1046－1048.