邱宇鶴　何淑云　王錦

[摘要] 艾滋病抗病毒治療對(duì)于病毒抑制和患者生存意義重大，但病毒耐藥問(wèn)題的出現(xiàn)已成為治療的嚴(yán)重威脅，不僅會(huì)導(dǎo)致個(gè)體治療的失敗，也會(huì)引發(fā)耐藥毒株的傳播風(fēng)險(xiǎn)，因此開展耐藥檢測(cè)工作十分必要。本文對(duì)耐藥檢測(cè)的意義、方法和應(yīng)用研究最新進(jìn)展加以綜述，從臨床和公共衛(wèi)生的角度為進(jìn)一步加強(qiáng)耐藥檢測(cè)工作，更有效的降低耐藥的發(fā)生、傳播和流行提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 艾滋?。蝗祟惷庖呷毕莶《?；耐藥檢測(cè)

[中圖分類號(hào)] R512.91 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）19-30-04

[Abstract] Antiviral therapy of acquired immunodeficiency syndrome （AIDs） is of great importance for virus inhibition and the survival of patients， but drug resistance of virus has been recognized as a serious threat to treatment， leading to failure of individual treatment and spreading risk of the drug resistant strains. Thus， drug resistance detection is very necessary. This paper generalizes the latest progress of significance， methods and applicative research of drug resistance to provide clinical and public health references for the further improvement of drug resistance detection and further reduction of occurrence， spreading and prevalence of drug resistance.

[Key words] Acquired immunodeficiency syndrome； Human immunodeficiency virus； Drug resistance detection

近年來(lái)艾滋病抗病毒治療工作呈現(xiàn)全球性的迅速發(fā)展，接受有效的抗病毒治療對(duì)于抑制病毒復(fù)制，降低發(fā)病率和死亡率，提高生命質(zhì)量具有重要意義。但目前人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）耐藥已成為抗病毒治療的重要問(wèn)題，不僅會(huì)影響個(gè)體自身治療，并且會(huì)引起耐藥毒株傳播流行的社會(huì)風(fēng)險(xiǎn)。面對(duì)HIV耐藥現(xiàn)狀，開展耐藥檢測(cè)不僅能夠指導(dǎo)評(píng)估、選擇和優(yōu)化調(diào)整臨床治療方案，還能夠?yàn)榉治瞿退幎局甑牧餍袪顩r、有效制定公共衛(wèi)生防治策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 HIV耐藥現(xiàn)狀

用于艾滋病治療的抗病毒藥物現(xiàn)已發(fā)展至6大類[1]，而治療方案也發(fā)展為不同分子靶點(diǎn)的多種藥物聯(lián)合作用，但是耐藥的出現(xiàn)嚴(yán)重影響治療效果，并且隨著抗病毒治療的推廣普及，HIV耐藥在全球已呈廣泛流行趨勢(shì)。Pham等[2]在2014年的一項(xiàng)系統(tǒng)性研究中指出，2009～2013年中/低收入國(guó)家高危人群的耐藥率較2004 ～ 2008年升高了近一倍，形勢(shì)非常嚴(yán)峻。更值得重視的是，耐藥的發(fā)生不止針對(duì)一線藥物，隨著新的抗病毒藥物及治療方案的應(yīng)用，新的耐藥突變也在不斷出現(xiàn)，當(dāng)前HIV耐藥已經(jīng)成為導(dǎo)致抗病毒治療失敗的主要因素[3]。

HIV耐藥是指HIV在通常能夠抑制其復(fù)制的藥物存在情況下復(fù)制的能力[4]，病毒逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，復(fù)制過(guò)程中存在高頻錯(cuò)誤傾向（約3×10-5 突變/堿基/復(fù)制周期）[5]，而病毒高速?gòu)?fù)制的特點(diǎn)加速了感染進(jìn)程中病毒突變的積累，在機(jī)體自身免疫和抗病毒藥物的選擇壓力下篩選出耐藥優(yōu)勢(shì)株。如果患者服藥依從性低引起血藥濃度波動(dòng)，會(huì)增加發(fā)生耐藥的危險(xiǎn)，對(duì)云南德宏州艾滋病患者接受抗病毒治療后耐藥突變情況的研究發(fā)現(xiàn)[6]，在353例成功進(jìn)行耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)突變檢測(cè)的患者中，有198例（56.1%）發(fā)現(xiàn)耐藥基因突變。HIV耐藥不但會(huì)影響患者自身治療效果，更會(huì)引起耐藥毒株流行的公共衛(wèi)生問(wèn)題。如楊洪等[7]報(bào)道2011年我國(guó)涼山州未治療人群原發(fā)耐藥率為5.43%（7/129），達(dá)到中度流行狀態(tài)。因此有效開展HIV耐藥檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)個(gè)體治療和防控HIV耐藥傳播都具有十分重要的意義。

2 HIV耐藥檢測(cè)方法

2.1 表型耐藥檢測(cè)

表型耐藥檢測(cè)原理是通過(guò)檢測(cè)在體外不同濃度抗病毒藥物存在情況下HIV病毒的復(fù)制能力，評(píng)價(jià)病毒對(duì)藥物的敏感性，結(jié)果以所檢毒株的50%抑制濃度（50% Inhibitory Concentration，IC50）與作為對(duì)照的野生毒株的 IC50的倍數(shù)改變來(lái)表示[8]，適用于復(fù)雜多位點(diǎn)的耐藥性突變檢測(cè)，可以用于評(píng)估新的抗病毒藥物。

作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法，外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）共培養(yǎng)法通過(guò)p24抗原定量來(lái)計(jì)算待測(cè)毒株的IC50，實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，對(duì)于技術(shù)和費(fèi)用的需求標(biāo)準(zhǔn)較高，同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中存在誘導(dǎo)出耐藥優(yōu)勢(shì)株的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)用具有局限性。除PMBC外，還有一些細(xì)胞系可作為指示細(xì)胞，比如穩(wěn)定表達(dá)CD4、CXCR4和CCR5受體的TZM-b1，并且TZM-b1細(xì)胞也可以被假病毒所感染[9]。以重組技術(shù)為基礎(chǔ)的假病毒表型耐藥檢測(cè)是將擴(kuò)增的HIV特定區(qū)域基因插入載體，用構(gòu)建的重組病毒進(jìn)行檢測(cè)。目前商品化的檢測(cè)試劑盒主要有：AntivirogramlTM、PhenoSense GTTM和PhenoscriptTM。假病毒表型耐藥檢測(cè)具有較高的安全性，過(guò)程相對(duì)較為快捷，能夠檢測(cè)病毒載量較低的樣本。徐萌等[10]通過(guò)構(gòu)建40株包含患者基因片段的假病毒對(duì)6組不同單藥和多藥進(jìn)行表型耐藥檢測(cè)，成功定量評(píng)估了樣本的耐藥水平，而楊婧等[11]對(duì)比研究了5種藥物的真病毒和假病毒表型耐藥檢測(cè)情況，數(shù)據(jù)表明兩種方法一致性較高，僅有對(duì)于齊多夫定的一個(gè)檢測(cè)結(jié)果存在耐藥程度的不同，其結(jié)果為假病毒表型耐藥檢測(cè)推廣應(yīng)用的適宜性提供了更多的支持。endprint

2.2 基因型耐藥檢測(cè)

基因型耐藥檢測(cè)基于分子生物學(xué)方法，擴(kuò)增基因組中耐藥相關(guān)的特定區(qū)域目的基因片段并進(jìn)行序列測(cè)定，利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)果解釋，操作簡(jiǎn)單，所用時(shí)間短。標(biāo)準(zhǔn)的基因型耐藥檢測(cè)的對(duì)象主要是蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域，隨著更多不同靶向藥物如整合酶抑制劑、CCR5拮抗劑等的應(yīng)用，檢測(cè)范圍也在不斷拓展[12]。Kagan等[13]在CCR5/CCR2雙重拮抗劑的臨床Ⅱ期試驗(yàn)中比較了基因型和表型耐藥檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者具有較高的一致性，而基因型耐藥檢測(cè)在檢測(cè)周期和成本上具備優(yōu)勢(shì)。

常用的HIV耐藥基因型檢測(cè)商品化試劑盒有TRUGENETM和ViroSeqTM，具備對(duì)應(yīng)的耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)，檢測(cè)成本昂貴。實(shí)驗(yàn)室自建的In-house方法一般用巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果分析常用斯坦福大學(xué)耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)（Stanford HIVdb），在常規(guī)化推廣中表現(xiàn)出更好的性價(jià)比[14]。李晶等[15]對(duì)In-house方法和TRUGENETM、ViroSeqTM兩種商品化試劑盒的檢測(cè)結(jié)果比較研究發(fā)現(xiàn)，三種方法的一致率達(dá)到99.42%（2933/2950）。病毒載量達(dá)到1000拷貝/毫升被認(rèn)為是推薦進(jìn)行耐藥檢測(cè)的閾值，但對(duì)低水平病毒血癥的患者開展耐藥檢測(cè)正在逐漸引起更多的重視。Gonzalez-Serna等[16]的研究顯示，采用實(shí)驗(yàn)室自建方法，病毒載量在50 ～ 249 拷貝/毫升之間的樣本成功率為74%，大于250 拷貝/毫升的成功率可以達(dá)到90%。

目前用于基因型耐藥檢測(cè)的樣本主要為抗凝全血或血漿，但對(duì)于樣本的保存運(yùn)輸條件要求較高。以濾紙作為載體的干血斑（Dried blood spots，DBS）樣本具備易采集處理、危險(xiǎn)性低、便于儲(chǔ)存運(yùn)輸、費(fèi)用低廉的優(yōu)勢(shì)，適合在資源環(huán)境條件有限的地區(qū)推廣應(yīng)用[17]。馬鵬飛等[18]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室自建方法，36份樣本中DBS的耐藥檢測(cè)結(jié)果有31份與血漿相比完全一致（86%）。但濾紙載體樣本也存在樣本量小、對(duì)于低病毒載量的患者檢測(cè)不準(zhǔn)確等問(wèn)題，WHO HIV耐藥實(shí)驗(yàn)室策略[19]中指出，干血漿斑（dried plasma spot，DPS）和干血清斑（dried serum spot，DSS）樣本不適合于耐藥監(jiān)測(cè)調(diào)查。

2.3 虛擬表型耐藥檢測(cè)

作為新型耐藥檢測(cè)方法的虛擬表型耐藥檢測(cè)在2001年由Graham等報(bào)道[20]，其原理是通過(guò)將基因型檢測(cè)結(jié)果的序列信息提交基因型-表型匹配的大容量數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)數(shù)據(jù)比對(duì)鑒別出與患者所帶毒株相似的基因型， 評(píng)估其對(duì)應(yīng)的表型信息的平均IC50 ，以分析所測(cè)毒株的可能表型。Jiamsakul等[21]研究顯示，基于Stanford HIVdb的基因型和基于vircoTYPETM的虛擬表型耐藥檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性。前文的Gonzalez-Serna等[16]也使用了虛擬表型方法進(jìn)行重復(fù)分析，獲得了非常相似的結(jié)果。虛擬表型耐藥檢測(cè)本質(zhì)上是對(duì)基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果的二次分析，是建立在實(shí)驗(yàn)室的具體檢測(cè)結(jié)果上的一種間接性預(yù)測(cè)，與表型耐藥檢測(cè)相比檢測(cè)成本低，顯著節(jié)約工作時(shí)間，已經(jīng)在美國(guó)、歐洲等推薦使用[22]，比如McFaul等[23]用虛擬表型方法有效評(píng)價(jià)了2011 ～ 2013年在倫敦未治療HIV感染人群中的的耐藥流行情況。

3 HIV耐藥檢測(cè)的應(yīng)用

HIV耐藥檢測(cè)對(duì)于個(gè)體抗病毒治療和公共衛(wèi)生層面的艾滋病防控工作意義重大。在臨床工作中，耐藥檢測(cè)能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)于患者進(jìn)行科學(xué)管理，優(yōu)化治療方案，提高抗病毒治療質(zhì)量。相對(duì)應(yīng)的是在治療藥物的選擇上，具備高耐藥屏障的藥物如整合酶抑制劑度魯特韋與其他藥物的聯(lián)合使用也更加受到關(guān)注[24]。我國(guó)艾滋病診療指南[25]推薦在抗病毒治療病毒載量下降不理想或抗病毒治療失敗需要改變治療方案時(shí)，和條件允許時(shí)在抗病毒治療前，進(jìn)行HIV基因型耐藥檢測(cè)。美國(guó)成人及青少年艾滋病抗病毒治療指南[1]建議對(duì)于已知或可能存在復(fù)雜耐藥突變位點(diǎn)，特別是蛋白酶抑制劑耐藥的情況下，聯(lián)合使用表型和基因型耐藥檢測(cè)。Luz等[26]在巴西的研究指出，在抗病毒治療開始前的基因型耐藥檢測(cè)能夠延長(zhǎng)預(yù)期壽命和節(jié)約成本，獲得更高的健康收益。

在公共衛(wèi)生領(lǐng)域，開展耐藥檢測(cè)有助于研究人員掌握HIV耐藥毒株的流行狀況、傳播趨勢(shì)和變化規(guī)律，科學(xué)有效的評(píng)估和應(yīng)對(duì)HIV耐藥風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)自2005年開始對(duì)HIV耐藥檢測(cè)方法進(jìn)行室間平行比對(duì)，至2009年已有19個(gè)省23家省市級(jí)實(shí)驗(yàn)室參加，累計(jì)提交的95份結(jié)果顯示97.7%總序列陽(yáng)性率，78.9%耐藥位點(diǎn)判讀完全一致率，76.8%序列編輯分析一致率，檢測(cè)能力和質(zhì)量總體不斷提高[27]?？紤]到直接來(lái)源于臨床樣本的考核品在安全性和穩(wěn)定性等方面要求嚴(yán)格，羅慧景等[28]提出將包含耐藥目的基因的重組質(zhì)粒作為基因型能力驗(yàn)證考核品，能夠達(dá)到反復(fù)凍融5次以上而保持穩(wěn)定性。HIV耐藥檢測(cè)是耐藥監(jiān)測(cè)工作的重要內(nèi)容，在確保耐藥檢測(cè)質(zhì)量，提升檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，將HIV耐藥檢測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查相結(jié)合，有效分析耐藥相關(guān)影響因素，可以為完善HIV耐藥的預(yù)防和控制策略提供參考，如肖占沛等[29]對(duì)江蘇省艾滋病患者耐藥及影響因素的調(diào)查研究結(jié)果顯示，不穩(wěn)定的居住狀況和低收入水平可能作為服藥依從性的相關(guān)因素影響耐藥，提示需要對(duì)于此類型重點(diǎn)人群給予更多的關(guān)注和干預(yù)。因此，做好HIV耐藥檢測(cè)工作，能夠?yàn)榻档虷IV耐藥的發(fā)生、傳播和流行，加強(qiáng)艾滋病防治工作提供科學(xué)指導(dǎo)和支持。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents[EB/OL]. Department of Health and Human Services，2014. http：//aidsinfo.nih.gov/ContentFiles/AdultandAdolescentGL.pdf.endprint

[2] Pham QD，Wilson DP，Law MG，et al. Global burden of transmitted HIV drug resistance and HIV-exposure categories：a systematic review and meta-analysis[J]. AIDS，2014，28（18）：2751-2762.

[3] Pennings PS. HIV drug resistance： problems and perspectives[J]. Infect Dis Rep，2013，5（Suppl 1）：21-25.

[4] World Health Organization. The HIV drug resistance report-2012[M]. World Health Organization，2012.

[5] Cortez KJ，Maldarelli F. Clinical management of HIV drug resistance[J]. Viruses，2011，3（4）：347-378.

[6] Yao S，Yang J，Zhou L，et al. Study on HIV viral load in plasma and drug resistance among AIDS patients receiving antiretroviral treatment in Dehong prefecture， Yunnan province[J]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2014，35（4）：411-416.

[7] 楊洪，蘇玲，王啟興，等. 涼山州部分彝族人群2011年 HIV 耐藥警戒線監(jiān)測(cè)研究[J]. 中國(guó)艾滋病性病，2015，21（1）：28-30.

[8] Tang MW，Shafer RW. HIV-1 Antiretroviral Resistance[J]. Drugs，2012，72（9）：e1-e25.

[9] Guo W，Li H， Zhuang D，et al. Impact of Y181C and/or H221Y mutation patterns of HIV-1 reverse transcriptase on phenotypic resistance to available non-nucleoside and nucleoside inhibitors in China [J]. BMC Infect Dis，2014，14：237.

[10] 徐萌，繩波，袁霖，等. 新型HIV-1表型耐藥系統(tǒng)臨床檢測(cè)應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)病毒病雜志，2014，49（4）：285-292.

[11] 楊婧，耿文清，張旻，等. HIV-1 基因型，假病毒表型與活病毒表型耐藥檢測(cè)結(jié)果的比較[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志（電子版），2014，8（3）：308-313.

[12] Dunn DT，Coughlin K，Cane PA. Genotypic resistance testing in routine clinical care[J]. Curr Opin HIV AIDS，2011，6（4）：251-257.

[13] Kagan RM，Johnson EP，Siaw MF， et al. Comparison of genotypic and phenotypic HIV type 1 tropism assay： Results from the screening samples of Cenicriviroc Study 202， a randomized phase II trial in treatment-naive subjects[J]. AIDS Res Hum Retroviruses，2014，30（2）：151-159.

[14] Chaturbhuj DN，Nirmalkar AP，Paranjape RS，et al. Evaluation of a cost effective In-House method for HIV-1drug resistance genotyping using plasma samples[J]. PLoS One，2014，9（2）：e87441.

[15] 李晶，蔣巖，呂超，等. 三種HIV-1基因型耐藥檢測(cè)方法的一致性評(píng)價(jià)[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，47（11）：1050-1055.

[16] Gonzalez-Serna A，Min JE，Woods C，et al. Performance of HIV-1 drug resistance testing at low-level viremia and its ability to predict future virologic outcomes and viral evolution in treatment-naive individuals[J]. Clin Infect Dis，2014，58（8）：1165-1173.

[17] Monleau M，Aghokeng AF，Eymard-Duvernay S， et al. Field evaluation of dried blood spots for routine HIV-1 viral load and drug resistance monitoring in patients receiving antiretroviral therapy in Africa and Asia[J]. J Clin Microbiol，2014，52（2）：578-586.endprint

[18] 馬鵬飛，邢輝，廖玲潔，等. 干血斑用于HIV-1耐藥基因型檢測(cè)的研究[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44（11）：993-998.

[19] World Health Organization. WHO/HIVResNet HIV drug resistance laboratory strategy[M]. World Health Organization，2010.

[20] Graham N， Peeters M， Verbiest W， et al. The virtual phenotype is an independent predictor of clinical response[C]. Program and abstracts of the 8th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections，2001：4-8.

[21] Jiamsakul A，Kantor R，Li PC，et al. Comparison of predicted susceptibility between genotype and virtual phenotype HIV drug resistance interpretation systems among treatment-naive HIV-infected patients in Asia： TASER-M cohort analysis[J]. BMC Res Notes，2012，5：582.

[22] Lengauer T，Pfeifer N，Kaiser R. Personalized HIV therapy to control drug resistance[J]. Drug Discov Today Technol，2014，11：57-64.

[23] McFaul K，Lim C，Jones R，et al. Transmitted antiretroviral drug resistance in treatment nave HIV-infected persons in London in 2011 to 2013[J]. J Int AIDS Soc，2014，17（Suppl 3）：19747.

[24] Cruciani M，Malena M. Combination dolutegravir–abacavir–lamivudine in the management of HIV/AIDS： clinical utility and patient considerations[J]. Patient Prefer Adherence，2015，9：299-310.

[25] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)艾滋病學(xué)組. 艾滋病診療指南（2011版）[J]. 中華傳染病雜志，2011，29（10）：629-640.

[26] Luz PM，Morris BL，Grinsztejn B，et al. Cost-Effectiveness of Genotype Testing for Primary Resistance in Brazil[J]. J Acquir Immune Defic Syndr，2015，68（2）：152-161.

[27] 邢輝，廖玲潔，鐘平，等. 中國(guó)2007-2009年HIV-1耐藥基因型檢測(cè)質(zhì)量評(píng)估結(jié)果[J]. 中國(guó)艾滋病性病，2012，18（4）：206-209，217.

[28] 羅慧景，李晶，范文成，等. HIV-1基因型耐藥檢測(cè)能力驗(yàn)證考核品的制備和評(píng)估[J]. 中國(guó)病毒病雜志，2015，5（1）：22-26.

[29] 肖占沛，宏雄，還錫萍，等. 江蘇省艾滋病患者HIV-1耐藥株的流行及影響因素研究[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，32（9）：1314-1319.

（收稿日期：2015-07-21）endprint