樊金玲,楊 睿,孫曉菲,朱文學(xué),劉勝男,白喜婷
(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023;2.三門(mén)峽出入境檢驗(yàn)檢疫局,河南 三門(mén)峽 472000)
榆樹(shù)葉中類胡蘿卜素的組成和含量
樊金玲1,楊 睿1,孫曉菲1,朱文學(xué)1,劉勝男2,白喜婷1
(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023;2.三門(mén)峽出入境檢驗(yàn)檢疫局,河南 三門(mén)峽 472000)
目的:分析榆樹(shù)葉中類胡蘿卜素主要組分的結(jié)構(gòu)和含量。方法:丙酮提取榆樹(shù)葉類胡蘿卜素,采用高效液相色譜與二極管陣列檢測(cè)器和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析類胡蘿卜素組分,依據(jù)其光譜和質(zhì)譜信息并與標(biāo)準(zhǔn)品和文獻(xiàn)相比較,確定主要類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu);采用高效液相色譜法測(cè)定不同采集時(shí)間的榆樹(shù)葉中主要類胡蘿卜素的含量。結(jié)果:葉黃素和β-胡蘿卜素為榆樹(shù)葉中主要的類胡蘿卜素組分,其含量因采集時(shí)間不同而異:葉黃素含量范圍為880.2~1 385.4 μg/g干樣,平均含量為1 098.3 μg/g干樣;β-胡蘿卜素含量范圍為142.8~364.2 μg/g干樣,平均含量為297.7 μg/g干樣。結(jié)論:榆樹(shù)葉有望成為葉黃素開(kāi)發(fā)的食品新資源。
榆樹(shù);葉;類胡蘿卜素;高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-質(zhì)譜法;葉黃素;β-胡蘿卜素
類胡蘿卜素屬萜類化合物,基本結(jié)構(gòu)為8 個(gè)異戊二烯單位通過(guò)共軛雙鍵構(gòu)成的多烯鏈,主要分為胡蘿卜素類和葉黃素類,前者是不含氧類胡蘿卜素的總稱,后者是含氧類胡蘿卜素的總稱[1]。類胡蘿卜素具有VA源活性,可用于預(yù)防和治療癌癥、心血管和眼部疾病,同時(shí)具有抗炎、抗紫外線損傷等多種生理功能[2-4];人體自身不能合成類胡蘿卜素,必需從膳食中獲取。目前,從天然資源中已分離出650多種類胡蘿 卜素,其中,僅有約60 種出現(xiàn)在人類膳食中,約20 種可以在人類血漿和組織中檢測(cè)到[5],含量最多的為葉黃素、番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃 質(zhì)和玉米黃質(zhì)[6]。在我國(guó)膳食中富含這些類胡蘿卜素的蔬菜主要有:胡蘿卜、南瓜、番茄和深綠色葉菜等。
使用吸收光譜儀和質(zhì)譜儀作為檢測(cè)器的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)是目前檢測(cè)類胡蘿卜素最常用色譜分析法。Murrillo等[7]采用HPLC-二極管陣列檢測(cè)器-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(HPLC-diode array detector-mass spectrometry,HPLC-DAD-APCI-MS)法分析了象牙果(A. aculeate)、魚(yú)腥草(Q. cordata)等6 種熱帶水果中的類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)。Kao等[8]采用HPLC-DAD-APCI-MS法分析了臺(tái)灣蒲公英(Taraxacum formosanum)中類胡蘿卜素的組成和含量。Ross等[9]采用HPLC-光電二極管陣列檢測(cè)-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-photo diode array detector-mass spectrometry-mass spectrometry,HPLC-PDA-MS-MS)法分析了錫蘭莓(D. abyssinicaWarb×D. hebecarpa Warb)、樹(shù)番茄(Cy phomandra betacea)果實(shí)中的類胡蘿卜素的組成和結(jié)構(gòu)。
榆樹(shù)(Ulmus pumila L.),又名白榆、家榆,為榆科榆屬植物,主要分布于東北、華北、西北及西南各省區(qū)[10]。我國(guó)民間也素有榆樹(shù)葉鮮食、拌面蒸制等食用歷史?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明榆樹(shù)具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌、抗炎、抑制前列腺增生等功能[11-14]。迄今為止,國(guó)內(nèi)外對(duì)榆樹(shù)葉生物活性成分的研究報(bào)道較少。本研究以開(kāi)發(fā)新食品資源為目的,采用HPLC-DAD-MS法分析榆樹(shù)葉類胡蘿卜素組分,通過(guò)各組分峰的特征光譜和質(zhì)譜信息,并通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品、文獻(xiàn)的比較,確定榆樹(shù)葉中類胡蘿卜素主要組分的結(jié)構(gòu);采用外標(biāo)法測(cè)定榆樹(shù)葉中主要類胡蘿卜素組分的含量。研究結(jié)果為綜合開(kāi)發(fā)利用榆樹(shù)植物資源提供理論依據(jù)。
1.1 材料與試劑
榆樹(shù)葉20 13年4~10月間每月采摘于河北省林科院苗圃,所采榆樹(shù)為3 a生,取樹(shù)冠中部葉。小心地用剪刀將樹(shù)葉剪下,洗凈凍干,于冰箱內(nèi)避光冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
丙酮(分析純)、甲醇(色譜純) 洛陽(yáng)昊華化學(xué)科技有限公司;葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度HPLC≥95%)、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
8C-2臺(tái)式低速離心機(jī) 上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠;1 01-ZA電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;RE-52A水浴蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器;2690高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)羅門(mén)哈斯公司。
1.3 方法
1.3.1 榆樹(shù)葉中類胡蘿卜素的提取
分別精確稱取同一批榆樹(shù)葉樣品3 份,每份0.600 0g,剪碎置于研缽中,加入少量石英砂,用40 mL冰丙酮[15]分多次研磨提取至無(wú)色;提取液在8 000 r/min條件下離心10 min以除去其中的葉片殘?jiān)?,繼而在30℃水浴條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸干,用10 mL冰丙酮復(fù)溶,作為樣品待測(cè)液。
1.3.2 榆樹(shù)葉類胡蘿卜素的HPLC-DAD-MS分析
HPLC條件:色譜柱:BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);檢測(cè)器:Waters Acquity DAD;流動(dòng)相A:水、流動(dòng)相B:甲醇、流動(dòng)相C:乙酸乙酯;梯度洗脫:0~5 min,水15%~8%、甲醇85%~92%;5~10 min,水8%~6%、甲醇92%~94%;10~12 min,水6%~5%、甲醇94%~95%;12~17 min,水5%、甲醇95%;17~25 min,水5%~0%、甲醇95%~100%;25~32 min,甲醇100%;32~37 min,甲醇100%~90%;37~52 min,甲醇90%~85%、乙酸乙酯10%~15%;52~67 min,甲醇85%~70%、乙酸乙酯15%~30%;67~70 min,甲醇70%~100%、乙酸乙酯30%~0%;柱溫25℃;進(jìn)樣量10 μL;流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm。
質(zhì)譜條件:電噴霧離子源;正離子掃描(m/z 100~1 500);毛細(xì)管電壓3.5 kV;錐孔電壓30 V;光電倍增器電壓650 V;離子源溫度100 ℃;脫溶劑氣溫度400 ℃。
1.3.3 榆樹(shù)葉類胡蘿卜素的定量分析
采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。
1.3.3.1 HPLC色譜條件
色譜條件同1.3.2節(jié)。
1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
分別精密稱取葉黃素、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品各2.5 mg,用冰丙酮溶液溶解并定容于25 mL棕色容量瓶中,搖勻,得到混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(100 μg/mL)。將儲(chǔ)備液分別稀釋為以下一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品使用液:10、20、40、50、60、80、100 μg/mL,進(jìn)行HPLC檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo),以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程。
1.3.3.3 榆樹(shù)葉中類胡蘿卜素的測(cè)定
取樣品待測(cè)液進(jìn)行HPLC分析,記錄峰面積,計(jì)算相對(duì)含量。
2.1 榆樹(shù)葉類胡蘿卜素的HPLC-DAD-MS分析
利用HPLC-DAD-MS技術(shù)分離并鑒定了榆樹(shù)葉中的主要類胡蘿卜素化合物。圖1為450 nm檢測(cè)波長(zhǎng)條件下,榆樹(shù)葉丙酮提取物的HPLC圖。共檢測(cè)到9 個(gè)主要的色譜峰,峰7在469 nm和650 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,峰8在432 nm和666 nm波長(zhǎng)處有最大吸收(圖略),分別與文獻(xiàn)報(bào)道的葉綠素b和葉綠素a的特征吸收峰一致,因此,峰7和峰8為葉綠素b和葉綠素a。其余色譜峰均不同程度地呈“三指峰”結(jié)構(gòu),為類胡蘿卜素物質(zhì),其中峰3、峰5和峰9為主要類胡蘿卜素物質(zhì),分別占類胡蘿卜素總峰面積的14.80%、32.98%、34.07%,光譜信息及質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。
表 1 榆樹(shù)葉類胡蘿卜素的光譜和質(zhì)譜信息Table 1 Chromatographic, UV-visible and mass spectroscopic characteristics of carotenoids from elm leaves
圖 1 榆樹(shù)葉類胡蘿卜素提取液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of carotenoids extracted from Ulmus pumila L.
峰3:保留時(shí)間為14.23 min,光譜圖及質(zhì)譜圖如圖2所示。分子離子峰[M]+m/z 600和準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 601,說(shuō)明其相對(duì)分子質(zhì)量600,分子式為C40H56O4;m/z 583和565分別為準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+失去一分子H2O和兩分子H2O所得[16-17],m/z 491為該分子多烯鏈上失去一個(gè)m/z 為92的片斷和一分子H2O所得(92+18)[1],m/z 221表明該合物結(jié)構(gòu)一側(cè)末端為β環(huán)環(huán)氧結(jié)構(gòu),并帶有一個(gè)羥基[18];其光譜圖顯示最大吸收峰為440、470 nm,表明該分子為9 個(gè)共軛雙鍵或8 個(gè)共軛雙鍵加一個(gè)累積二烯,均在鏈上[19]。結(jié)合質(zhì)譜圖和光譜圖可判斷:當(dāng)分子結(jié)構(gòu)中存在鏈上9 個(gè)共軛雙鍵時(shí),分子的另一末端為帶羥基的β環(huán)-5,6環(huán)氧結(jié)構(gòu);當(dāng)分子結(jié)構(gòu)中的鏈上部分為8 個(gè)共軛雙鍵加一個(gè)累積二烯時(shí),分子的另一末端為帶有2個(gè)羥基的環(huán)結(jié)構(gòu)。綜合以上信息,推測(cè)峰2可能為新黃質(zhì)或紫黃質(zhì);m/z 399、m/z 360分別為雙鍵C7~C8和C9~C10處斷裂并失去2 個(gè)OH所得[18],m/z 221和m/z 299分別為C10~C11和C15~C15′處斷裂所得,其分子結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜碎裂模式如圖3所示。
圖 2 峰2的光譜圖和質(zhì)譜圖(峰號(hào)見(jiàn)圖1)Fig.2 UV-Vis and mass spectrum of peak 2 shown in Fig.1
圖 3 峰3的質(zhì)譜碎裂模式(電噴霧電離正離子模式)(峰號(hào)見(jiàn)圖1)Fig.3 Mass fragmentation pattern of peaks 3 shown in Fig.1 under ESIMS in positive ion mode
峰5:保留時(shí)間為22.48 min,光譜圖及質(zhì)譜圖如圖4所示。其光譜圖表明最大吸收峰為446、474 nm,表明該化合物發(fā)色團(tuán)為10 個(gè)共軛二烯,其中一個(gè)在β環(huán)。其分子離子峰[M]+m/z 568和準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 569,m/z 599為[M+Na]+,說(shuō)明其相對(duì)分子質(zhì)量為568,分子式為C40H56O2。m/z 551為準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+失去一分子H2O所得;m/z 476為該分子多烯鏈上失去一個(gè)m/z 為92的片斷所得;m/z 175和m/z 360為C9~C10斷裂并失去一個(gè)OH所得;無(wú)m/z 221,表明該合結(jié)構(gòu)一側(cè)末端不含β環(huán)-環(huán)氧-羥基結(jié)構(gòu)。甲基化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該化合物存在烯丙基羥基,表明該化合物一側(cè)末端為ε-羥基。結(jié)合以上信息,推測(cè)該化合物為葉黃素。將該化合物的保留時(shí)間、光譜圖和質(zhì)譜圖與葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了對(duì)比,二者完全一致,表明峰5為葉黃素。其分子結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜碎裂模式如圖5所示。
圖 4 峰5的光譜圖和質(zhì)譜圖(峰號(hào)見(jiàn)圖1)FFiigg..44 UUVV--vviissiibbllee aanndd mmaassss ssppeeccttrruumm ooff ppeeaakk 55 sshhoowwnn iinn FFiigg..11
圖 5 峰5的質(zhì)譜碎裂模式(電噴霧電離正離子模式,峰號(hào)見(jiàn)圖1)Fig.5 Mass fragmentation pattern of peaks 5 under ESIMS in positive ion mode
峰9:保留時(shí)間為61.93 min,光譜圖及質(zhì)譜圖如圖6所示。其光譜圖表明最大吸收峰為451、476 nm,表明該化合物發(fā)色團(tuán)為11 個(gè)共軛二烯,其中二個(gè)在β環(huán)。其分子離子峰[M]+m/z 536和準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 537,說(shuō)明其相對(duì)分子質(zhì)量為568,分子式為C40H56;m/z 444為該分子多烯鏈上失去一個(gè)m/z 92的片斷所得;m/z 177和m/z 359為C9~C10斷裂所得;結(jié)合以上信息,推測(cè)該化合物為β-胡蘿卜素。將該化合物的保留時(shí)間、光譜圖和質(zhì)譜圖與β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了對(duì)比,二者完全一致,表明峰9為β-胡蘿卜素。其分子結(jié)構(gòu)及質(zhì)譜碎裂模式如圖7所示。
圖 6 峰9的光譜圖和質(zhì)譜圖(峰號(hào)見(jiàn)圖1)Fig.6 UV-visible and mass spectrum of peak 9 shown in Fig.1
圖 7 峰9的質(zhì)譜碎裂模式(電噴霧電離正離子模式,峰號(hào)見(jiàn)圖1)Fig.7 Mass fragmentation pattern of peak 9 under ESIMS in positive ion mode
2.2 榆樹(shù)葉中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量分析
采用高效液相色譜分析、外標(biāo)法測(cè)定了2013年4月至10月間采集的榆樹(shù)葉中主要類胡蘿卜素、葉黃素和β-胡蘿卜素含量,結(jié)果如圖8所示。榆樹(shù)葉中葉黃素和β-胡蘿卜素含量因采集時(shí)間不同而異:葉黃素含量范圍為880.2~1 385.4 μg/g干樣,平均含量為1 098.3 μg/g干樣;其中,7月份采集樣品的葉黃素含量較高。β-胡蘿卜素含量范圍為142.8~364.2 μg/g干樣,平均含量為297.7 μg/g干樣,除4月份采集樣品含量較低外,其他月份之間的差異不顯著。
植物類胡蘿卜素位于葉綠體和有色體膜中,是植物光合作用的輔助色素;一方面,幫助葉綠素接收光能;另一方面,在高溫、強(qiáng)光條件下能通過(guò)葉黃素循環(huán),以非輻射的方式耗散光系統(tǒng)Ⅱ的過(guò)剩能量保護(hù)葉綠素免受破壞[20-22]。本實(shí)驗(yàn)表明:在生長(zhǎng)初期(4月份)榆樹(shù)葉片的葉黃素和β-胡蘿卜素含量較低。隨著幼葉的成長(zhǎng),二者含量也逐漸增加,至夏季(7月份)葉片完全發(fā)育成熟時(shí),類胡蘿卜素含量達(dá)到最大值;其后,隨著葉片的衰老,榆樹(shù)葉葉黃素和β-胡蘿卜素含量逐漸呈下降的趨勢(shì);至10月份,葉黃素和β-胡蘿卜素含量又有小幅度上升(盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著),這可能與類胡蘿卜素是合成植物激素脫落酸的前體有關(guān)[23]。
葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素,具有多種生理活性,能抵御游離基在人體內(nèi)造成的細(xì)胞與器官損傷,可有效預(yù)防動(dòng)脈硬化,增強(qiáng)免疫力,在預(yù)防癌變發(fā)生、延緩癌癥發(fā)展、抑制黃斑變性等方面具有重要作用[24-25]。美國(guó)食品與藥品管理局早于1995年已批準(zhǔn)葉黃素作為食品補(bǔ)充劑。我國(guó)衛(wèi)生部2007年第8號(hào)文件規(guī)定,葉黃素作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑,可用于嬰兒、較大嬰兒、幼兒和學(xué)齡前兒童的配方食品;2008年衛(wèi)生部批準(zhǔn)葉黃素酯為新功能食品原料。葉黃素在食用蔬菜、水果中含量較低;羽衣甘藍(lán)和菠菜是食物中葉黃素含量較高的蔬菜品種,其葉黃素含量分別為64~150 μg/g鮮質(zhì)量(平均含量107 μg/g鮮質(zhì)量)和39~95 μg/g鮮質(zhì)量(平均含量65 μg/g 鮮質(zhì)量)[26]。本研究測(cè)得榆樹(shù)葉中的葉黃素平均含量1 098.3 μg/g干樣,折合約為351 μg/g鮮質(zhì)量(榆樹(shù)葉含水量為67.84%±0.49%),分別為羽衣甘藍(lán)和菠菜的3.3 倍和5.4 倍。萬(wàn)壽菊是目前工業(yè)提取葉黃素的主要原料,不同品種萬(wàn)壽菊的葉黃素含量為170~5 700 μg/g干質(zhì)量[27],平均含量約為1 700 μg/g干質(zhì)量[28];榆樹(shù)葉中葉黃素平均含量約為萬(wàn)壽菊的65%。鑒于榆樹(shù)葉可食、可入藥,且葉黃素含量較高,因此可以考慮開(kāi)發(fā)明目食品、保健品等為人們利用。
葉黃素和β-胡蘿卜素為榆樹(shù)葉中主要的類胡蘿卜素組分,其含量因采集時(shí)間不同而異:葉黃素含量范圍為880.2~1385.4 μg/g干樣,平均含量為1 098.3 μg/g干樣;β-胡蘿卜素含量范圍為142.8~364.2 μg/g干樣,平均含量為297.7 μg/g干樣。榆樹(shù)葉有望成為葉黃素開(kāi)發(fā)的食品新資源。
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Identifi cation and Quantifi cation of Carotenoids in Leaves of Ulmus pumila L.
FAN Jinling1, YANG Rui1, SUN Xiaofei1, ZHU Wenxue1, LIU Shengnan2, BAI Xiting1
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. Sanmenxia Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Sanmenxia 472000, China)
Objective: To determine the structures and contents of major carotenoids in leaves of elm (Ulmus pumila L.) collected at different time points during one year. Methods: Carotenoids from elm leaves were extracted using acetone. The major carotenoids were analyzed with the use of high performance liquid chromatography with diode array detection coupled to mass spectrometry (HPLC-DAD-MS) and identifi ed by comparison of UV-visible and mass spectral data with reference standards or data reported in the literature. The contents of major carotenoids were measured by HPLC. Results: Two major carotenoids were identifi ed as lutein and β-carotene. The level ranged from 880.2 to 1385.4 μg/g (dry weight) for lutein and from 142.8 to 364.2 μg/g (dry w eight) for β-carotene with an average content of 1098.3 and 297.7 μg/g (dry weight), respectively. Conclusion: Ulmus pumila L. is a new resource of lutein.
Ulmus pumila L.; leaves; carotenoids; high performance liquid chromatography-diode array detector-mass spectrometry (HPLC-DAD-MS); lutein; β-carotene
O629.4
A
1002-6630(2015)02-0155-05
10.7506/sp kx1002-6630-201502030
2014-06-27
樊金玲(1973—),女,教授,博士,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail:fanjinling@haust.edu.cn