李梅青，張 瑜，代蕾莉，孔祥淋，杜曉妹

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽 合肥 23 0036）

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取明綠豆SOD工藝

李梅青1,2，張 瑜1，代蕾莉1，孔祥淋1，杜曉妹1

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽 合肥 23 0036）

為了充分提取明綠豆中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），選用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響磷酸鹽緩沖液提取明綠豆SOD比活力的7 個(gè)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出具有顯著效應(yīng)的3 個(gè)因素液固比、磷酸鹽緩沖液pH值和超聲水浴溫度。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化出主要影響因素的最佳參數(shù)水平。結(jié)果表明：采用液固比22∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 7、超聲功率140 W、超聲時(shí)間 20 min、超聲水浴溫度44 ℃、水浴浸提時(shí)間1.5 h、水浴浸提溫度60 ℃的組合，明綠豆SOD的實(shí)際比活力為856.95 U/mg。與傳統(tǒng)SOD源相比，明綠豆SOD含量處于較高水平，可成為一種新的植物SOD源。

明綠豆；超氧化物歧化酶；超聲輔助提?。籔lackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)；響應(yīng)面設(shè)計(jì)

綠豆，為豆科草本植物綠豆（Phaseolus radiatus）的成熟種子?！侗静菥V目》云：“綠豆，消腫治痘之功雖同于赤豆，而壓熱解毒之力過之”；并可“解金石、砒霜、草木一切諸毒”。《本草求真》曰：“綠豆味甘性寒，能厚腸胃、潤(rùn)皮膚、和五臟及資脾胃”。現(xiàn)代藥理研究表明綠豆具有抗菌抑菌[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、提高免疫力[4]、降血脂[5]、解毒[6]等作用。

SOD能快速有效地清除體內(nèi)的超氧陰離子自由基，在防止生物體免受超氧陰離子自由基損傷[7]、抗輻射、抗腫瘤、提高人體免疫力、抗壓力和疲勞[8-9]、預(yù)防局部缺血再灌注損傷[10]、治療動(dòng)脈血管粥樣硬化[11]、治療脂溢性皮膚炎癥[12]及延緩機(jī)體衰老等方面起到重要作用[13]，在食品、農(nóng)業(yè)及化妝品行業(yè)的應(yīng)用也越來越廣泛[14]。但是過去大多從血液中提取，不僅工藝復(fù)雜、制備成本高、不易常溫保存，且存在艾滋病等血液病毒交叉感染的潛在危險(xiǎn)。植物SOD則有較高的使用安全性，國(guó)際衛(wèi)生組織已停止動(dòng)物性SOD的使用[15]。所以，從植物源中獲取SOD正成為熱點(diǎn)。

明光綠豆以其色澤晶瑩碧綠、粒大皮薄、湯清易爛、清香可口等特點(diǎn)，質(zhì)量為全國(guó)之冠，被稱為“明綠”，曾經(jīng)被作為貢品。2008年，“明光綠豆”獲得國(guó)家原產(chǎn)地保護(hù)標(biāo)志，以下簡(jiǎn)稱“明綠豆”。國(guó)內(nèi)尚無從明綠豆中提取SOD的相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以明綠豆為材料，以磷酸鹽緩沖液代替有機(jī)溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16]和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17-18]對(duì)其SOD的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為開發(fā)利用明綠豆SOD酶源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明綠豆由安徽燕之坊食品有限公司提供。

鄰苯三酚 上海生化試劑所；考馬斯亮藍(lán)G-250上海綠鳥科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋白 美國(guó)Simga公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LR16-A高速冷凍離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；UV-5800PC掃描型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；KQ5200DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活性及蛋白質(zhì)的測(cè)定

SOD酶活力的測(cè)定采用修正的鄰苯三酚自氧化法[19]：一定條件下，在1 mL反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量為1 個(gè)酶活力單位（1U）。

蛋白質(zhì)的測(cè)定：參照考馬斯亮藍(lán)G-250法[20]，以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

SOD比活力按下面公式計(jì)算：

1.3.2 明綠豆SOD提取工藝流程

明綠豆→低溫粉碎并過40 目篩→超聲輔助磷酸鹽緩沖液（內(nèi)含1 mmol/L的EDTA）提取→熱水浴處理→離心（4 ℃、10 000 r/min、20 min）→SOD粗提取液（上清液）

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以明綠豆SOD比活力為指標(biāo)，考察7個(gè)影響明綠豆SOD比活力的因素，得出單因素對(duì)SOD比活力的變化規(guī)律，并確定7 個(gè)單因素的最佳值。單因素試驗(yàn)采用的固定參數(shù)分別為：液固比20∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 7.6、超聲功率100 W、超聲水浴溫度40 ℃、超聲時(shí)間20 min、水浴浸提溫度50 ℃、水浴浸提時(shí)間2 h。分別固定其中的6個(gè)因素，變化另1個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，因素變化范圍分別為：液固比5∶1～30∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 6.4～8.0、超聲功率80～200 W、超聲水浴溫度25～45 ℃、超聲時(shí)間5～25 min、水浴浸提溫度30～70 ℃、水浴浸提時(shí)間1～3 h。

1.3.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)上述影響因素進(jìn)行篩選。每個(gè)因素分別取低（—1）和高（+1）兩個(gè)水平，共12 個(gè)試驗(yàn)組合。每個(gè)處理重復(fù)3 次，取平均值為試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)明綠豆SOD提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。利用Design-Expert 8.0.5b軟件，采用Box-Behnken建立三因素三水平數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液固比對(duì)SOD比活力的影響

圖 1 液固比對(duì)SOD比活力的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction rate of SOD

由圖1可知，在液固比5∶1～20∶1（mL/g）范圍內(nèi)，明綠豆SOD比活力隨著溶劑體積的增大而增大，這主要是由于溶劑中溶質(zhì)的濃度差和溶劑能夠溶解的物質(zhì)的量在不斷增大導(dǎo)致的。在液固比達(dá)到20∶1（mL/g）后，SOD比活力逐漸的下降。不同液固比條件下，所得SOD比活力有顯著性差異（P＜0.05）?？紤]到SOD的提取率及提取難度問題，確定明綠豆SOD提取的液固比為20∶1（mL/g）。

2.1.2 磷酸鹽緩沖液pH值對(duì)SOD比活力的影響

圖 2 磷酸鹽緩沖液pH值對(duì)SOD比活力的影響Fig.2 Effect of phosphate buffer pH on the extraction rate of SOD

由圖2可以看出，磷酸鹽緩沖液pH 6.8時(shí)SOD的比活力最高，隨后磷酸鹽緩沖液pH值繼續(xù)增加則導(dǎo)致SOD比活力逐漸降低，pH值越偏離6.8，SOD比活力差異越顯著（P＜0.05）。因?yàn)镾OD有一定的酸堿耐受性，pH值過低或過高都會(huì)影響酶活，所以pH 6.8磷酸鹽緩沖液較適宜提取SOD。

2.1.3 超聲功率對(duì)SOD比活力的影響

圖 3 超聲功率對(duì)SOD比活力的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of SOD

由圖3可知，明綠豆SOD比活力在80～140 W范圍內(nèi)隨著超聲功率的增大而增大，當(dāng)超聲功率達(dá)到140 W時(shí)，酶比活力最大。80～140 W范圍內(nèi)時(shí)SOD比活力之間的差異極顯著，之后差異顯著。這主要是因?yàn)殡S著功率的增加，溶質(zhì)的擴(kuò)散速度也增大，當(dāng)功率達(dá)到一定程度后，溶質(zhì)擴(kuò)散速率的增加對(duì)酶的提取影響減小?？紤]到能量的消耗和成本問題，選擇超聲功率為140 W較適宜。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)SOD比活力的影響

圖 4 超聲時(shí)間對(duì)SOD比活力的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction rate of SOD

由圖4可知，5～20min范圍內(nèi)，SOD比活力隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)且差異顯著（P＜0.05），當(dāng)超聲20 min時(shí)，SOD比活力達(dá)到最大值。20 min后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD比活力略有下降。由Fick擴(kuò)散定律可知得率與提取時(shí)間呈正比，在一定條件下，超聲時(shí)間越長(zhǎng)得率越高[16]；但是時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使擴(kuò)散次數(shù)降低，反而影響SOD的得率。所以，本試驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為20 min。

2.1.5 超聲水浴溫度對(duì)SOD比活力的影響

圖 5 超聲水浴溫度對(duì)SOD比活力的影響Fig.5 Effect of ultrasonic-waterbath temperature on the extraction rate of SOD

由圖5可知，超聲水浴溫度對(duì)SOD比活力影響差異顯著，在25～40 ℃范圍內(nèi)，溫度升高能提高明綠豆SOD的得率。當(dāng)溫度超過40 ℃時(shí)，SOD比活力逐漸降低。這可能是因?yàn)楦邷匾鸺?xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化[21]，從而使SOD容易轉(zhuǎn)移到溶液中。但是，過高的溫度又會(huì)引起SOD結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞SOD的活性。所以，選取40 ℃作為提取超聲水浴溫度。

2.1.6 水浴浸提時(shí)間對(duì)SOD比活力的影響

圖 6 水浴浸提時(shí)間對(duì)SOD比活力的影響Fig.6 Effect of subsequent waterbath extraction duration on the extraction rate of SOD

由圖6可知，水浴浸提時(shí)間過短，達(dá)不到分離提取效果，影響提取SOD的純度，提取時(shí)間過長(zhǎng)又使SOD比活力損失明顯，試驗(yàn)表明浸提時(shí)間為1.5 h較適宜。

2.1.7 水浴浸提溫度對(duì)SOD比活力的影響

圖 7 水浴浸提溫度對(duì)SOD比活力的影響Fig.7 Effect of subsequent waterbath temperature on the extraction rate of SOD

圖7表明，在30～60 ℃水浴中進(jìn)行熱處理時(shí)，SOD比活力先隨著水浴溫度的升高而升高且差異顯著，然后逐漸降低。水浴浸提溫度不僅由蛋白質(zhì)溶解度特性決定，還與酶的最適溫度有關(guān)。故本試驗(yàn)最合適水浴浸提溫度選60 ℃。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)關(guān)鍵影響因素的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表1。利用Mintab1 5.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表 1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 1 Plackett-Burman design and results

表 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA of Plackett-Burman design experiments

由表2可知，主效應(yīng)P值為0.045，表明Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素在所選取的水平范圍內(nèi)對(duì)明綠豆SOD比活力的影響顯著，同時(shí)決定系數(shù)R2為0.900 8，說明回歸有效，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。

由表2還可以看出，液固比、磷酸鹽緩沖液pH值、超聲水浴溫度是影響明綠豆SOD比活力的主要因素，所以在下一步的響應(yīng)面分析中，重點(diǎn)考察這3 個(gè)因素的最優(yōu)水平范圍。其他條件采用單因素試驗(yàn)的最佳條件：超聲功率140 W、超聲時(shí)間20 min、水浴浸提時(shí)間1.5 h、水浴浸提溫度60 ℃。

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表 3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design and results

表 4 明綠豆SOD提取參數(shù)回歸方差分析Table 4 ANOVA of quadratic polynomial model

經(jīng)回歸擬合后，得到以明綠豆SOD比活力（Y）為響應(yīng)值的回歸方程為：

Y=853.10+121.10A—5.81B—13.48C—53.95AB+ 41.14AC+96.04BC—223.06A2—208.25B2—74.93C2

由表4可知，模型的P值小于0.001，表明該模型二次方程極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.468 7）。各因素對(duì)明綠豆SOD比活力影響大小順序：液固比＞超聲水浴溫度＞磷酸鹽緩沖液pH值。一次項(xiàng)A極顯著，二次項(xiàng)A2、BC、B2、C2極顯著，交互項(xiàng)AB顯著。回歸方程決定系數(shù)R2為0.980 7，說明該回歸方程能很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以用其確定最佳提取工藝條件。

圖 8 液固比、磷酸鹽緩沖液pH值和超聲水浴溫度交互影響明綠豆SOD比活力的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots for the interactive effects of solid-to-liquid ratio, ultrasonic-waterbath temperature and phosphate buffer pH on the specifi c activity of SOD

比較圖8及方差分析結(jié)果可知，液固比表現(xiàn)為曲線較陡，說明對(duì)明綠豆SOD比活力的影響最為顯著，液固比最佳值在22∶1（mL/g）左右，而超聲水浴溫度表現(xiàn)為曲線較為平滑，磷酸鹽緩沖液pH值次之，它們的最佳值分別在44 ℃和7左右。

2.3.2 模型的驗(yàn)證

通過回歸模型預(yù)測(cè)的明綠豆SOD最佳提取工藝參數(shù)為：液固比22.27∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH6.94、超聲水浴溫度44.47 ℃。在此條件下，明綠豆SOD比活力理論上可達(dá)到855.67 U/mg。考慮到實(shí)際操作的可行性，將明綠豆的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為：液固比22∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 7、超聲水浴溫度44 ℃。

在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均值為856.95 U/mg，理論值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)偏差為0.15%。說明采用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化明綠豆SOD提取條件是可行的，所得SOD提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

經(jīng)過Plackett-Burman試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法優(yōu)化，明綠豆SOD提取的最佳工藝參數(shù)為：液固比22∶1（mL/g）、磷酸鹽緩沖液pH 7、超聲功率140 W、超聲時(shí)間20 min、超聲水浴溫度44 ℃、水浴浸提時(shí)間1.5 h、水浴浸提溫度60 ℃。此時(shí)明綠豆SOD的實(shí)際比活力為856.95 U/mg。不同來源SOD的比活力有所不同，已有的研究發(fā)現(xiàn)馬血、鴨血中SOD比活力為77.5[22]、 1 000.91 U/mg[23]；番茄、沙棘、仙人掌中SOD活力分別為55.5[24]、64.94[25]、215 U/mL[26]；紅酵母、啤酒廢酵母中SOD比活力達(dá)199.59[27]、31.75 U/mg[28]。與上述結(jié)果相比，除鴨血外，明綠豆中的SOD比活力均遠(yuǎn)高于其他來源的SOD比活力，說明利用明綠豆提取SOD是可行的，明綠豆可以成為一種新的植物SOD源。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of SOD from “Ming” Mung Bean by Plackett-Burman Design and Response Surface Methodology

LI Meiqing1,2, ZHANG Yu1, DAI Leili1, KONG Xianglin1, DU Xiaomei1
(1. School of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Institute of Hefei Agricultural Products Processing, Hefei 230036, China)

An optimized ultrasonic-assisted procedure was proposed for the exhaustive extraction of superoxide dismutase (SOD) from “Ming” mung bean, a famous cultivar in Mingguang, Anhui province. Seven operating parameters were screened for their effects on the specifi c activity of SOD using Plackett-Burman design, and solvent-to-solid ratio, phosphate buffer pH and ultrasonic-waterbath temperature were identifi ed as the most signifi cant variables. Subsequently, the levels of the three variables were optimized by response surface methodology. The optimal extraction conditions for SOD were determined as phosphate buffer at pH 7 as the extraction solvent with a solvent-to-solid ratio of 22:1 (mL/g), waterbath extraction at 44 ℃ with an ultrasonic power of 140 W for 20 min and subsequently at 60 ℃ for additional 1.5 h without ultrasonication. Under these conditions, the specifi c activity of SOD was 856.95 U/mg. “Ming” mung bean as a new source of SOD contained more abundant SOD when compared with the traditional sources.

“Ming” mung bean; SOD; ultrasonic-assisted extraction; Plackett-Burman design; response surface methodology

R284.2

A

1002-6630（2015）02-0069-06

10.7506/spkx1002-6630-201502013

2014-06-30

合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院資助院企合作項(xiàng)目（2012HAPP002）

李梅青（1965—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：lmq@ahau.edu.cn