劉 韜，李 榮*，張祿捷，姜子濤

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

八角 茴香葉中黃酮的微波提取及純化

劉 韜，李 榮*，張祿捷，姜子濤

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

通過Plackett-Bu rman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法確定八角茴香葉黃酮的最佳微波提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)67%、液料比26∶1、微波溫度75℃、微波起始功率500W、微波時(shí)間8 min。在此條件下，黃酮的得率為6.97%。采用D101大孔樹脂和制備色譜兩種方式純化八角茴香葉黃酮，結(jié)果表明制備色譜不僅能夠高效快速地純化八角茴香葉黃酮，并且能夠?qū)S酮成分進(jìn)行初步分離。

八角茴香葉；響應(yīng)面；大孔樹脂；制備色譜

八角茴香（Illicium verum Hook. f.）為木蘭科八角屬植物，別名大料、八角、大茴香。八角茴香原產(chǎn)于我國(guó)的廣 西，現(xiàn)云南、福建、浙江、廣東以及越南與我國(guó)接壤的地區(qū)也有栽培。八角茴香的果實(shí)是中國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味香料和中藥材[1-2]。除用于食品的調(diào)味外，也用于治療嘔吐、胃痛、失眠、皮膚紅腫和風(fēng)濕痛等癥[3-6]。關(guān)于八角茴香果實(shí)化學(xué)成分的研究，已有八角茴香油[7]、莽草酸[8-9]和其他倍半萜內(nèi)酯[10-11]方面的報(bào)道。但目前對(duì)八角茴香葉的化學(xué)成分的研究還很少，八角茴香葉來源豐富，且可用來提取八角茴香葉油，每100kg八角茴香鮮葉可生產(chǎn)八角茴香葉油0.8～1. 0kg[12]。杜正彩等[13]優(yōu)化了從八角茴香枝葉提取揮發(fā)油所產(chǎn)生的廢水中分離莽草酸的工藝。另外，八角茴香葉富含黃酮類化合物，莫麗玲等[14]報(bào)道了八角茴香葉總黃酮的提取方法，并測(cè)定了該黃酮混合物清除自由基的能力；鮑泥滿等[15]從八角枝葉中分離出2 種黃酮類成分；易國(guó)富等[16]測(cè)定了八角茴香葉的黃酮苷元的種類及其含量。

為了充分利用八角茴香葉資源，本研究采用微波輔助快速提取的方式[17]提取了八角茴香葉黃酮，大大縮短了八角茴香葉黃酮的提取時(shí)間，通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法確定了微波輔助提取八角茴香葉黃酮的最佳條件。并且利用大孔吸附樹脂和制備色譜對(duì)所獲得的黃酮進(jìn)行了提純，為八角茴香葉的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八角茴香葉產(chǎn)自廣西壯族自治區(qū)河池市，經(jīng)清洗后在70℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎約40目備用。

D101聚苯乙烯交聯(lián)二乙烯苯型非極性大孔樹脂、AB-8聚苯乙烯交聯(lián)二乙烯苯弱極性大孔樹脂、NKA-9聚苯乙烯交聯(lián)二乙烯苯極性大孔樹脂、聚酰胺型大孔樹脂南開大學(xué)化學(xué)工廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（分析純） 北京化學(xué)試劑公司；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；甲醇（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚（分析純，沸程30～60℃） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Grace RevelerisTM全息快速純化色譜系統(tǒng)、SSI 1500高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備四元梯度泵） 美國(guó)Alltech公司；Lambda 25紫外-可見分光光度計(jì) 珀金埃爾默儀器有限公司；Multisynth微波合成儀 意大利Milestone公司；Alpha-1500紫外-可見分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司；FA1104N型電子天平 上海精密儀器有限公司；RE52-86A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 八角茴香葉黃酮微波提取工藝

稱取1.0g八角茴香葉粉末，放入微波合成儀的圓底燒瓶中，加入一定比例的乙醇溶液，在一定的微波功率、微波溫度和微波時(shí)間條件下，用微波合成儀萃取，待提取液冷卻后過濾，濾液經(jīng)石油醚萃取3 次，棄去石油醚層，所得濾液定容至30 mL作為黃酮提取液。

1.3.2 提取條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

確定Plackett-Burman試驗(yàn)的因素及水平，包括乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波溫度、微波時(shí)間、微波起始功率5 個(gè)因素以及每個(gè)因素的高低2 個(gè)水平，共12 組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，響應(yīng)值為268 nm波長(zhǎng)處的吸光度。Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平見表1。

表 1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以268 nm波長(zhǎng)處吸光度為響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波溫度作為3 個(gè)影響因素，每個(gè)因素設(shè)定高中低三水平，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)方案，共計(jì)15 組試驗(yàn)。其中，中心試驗(yàn)重復(fù)3 次，編碼水平見表2。

表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素編碼及水平Table 2 Factors and levels used in response surface design

1.3.3 八角茴香葉黃酮含量測(cè)定

取1.0 mL提取液，按照1∶40稀釋，于268 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線得到黃酮質(zhì)量濃度，按式（1）計(jì)算黃酮得率：

式中：K為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積/mL；ρ為黃酮質(zhì)量濃度/（mg/L）；M為八角葉質(zhì)量/mg。

1.3.4 八角茴香葉黃酮樣品液的制備

按照1.3.1節(jié)方法在最佳工藝條件下得到黃酮提取液，再經(jīng)減壓旋蒸至無(wú)乙醇后，冷凍干燥。稱取冷凍干燥的八角茴香葉粗黃酮粉末0.5 g，加入少量乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中用水定容，即得1.0 mg/mL的八角茴香葉粗黃酮儲(chǔ)備液，為樣品液備用。

1.3.5 大孔吸附樹脂的篩選

1.3.5.1 樹脂預(yù)處理

將大孔樹脂于體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中浸泡12h，用蒸餾水洗至無(wú)醇，然后用5% HCl溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至流出液pH值為中性，之后用5% NaOH溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至流出液pH值為中性，用蒸餾水浸泡備用[18]。

1.3.5.2 樹脂的靜態(tài)吸附與解吸

稱取經(jīng)預(yù)處理的D101、AB-8、NKA-9或聚酰胺大孔樹脂各1.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入20 mL樣品液（1.0 mg/mL），室溫條件下水浴振蕩24 h，分別掃描經(jīng)大孔樹脂吸附的上清液（按1∶10稀釋）吸收光譜。

將上述吸附黃酮的大孔樹脂分別轉(zhuǎn)移至新的100 mL具塞瓶中，分別加入20 mL 70%乙醇溶液，室溫條件下水浴振蕩24 h，掃描解吸液（按1∶10稀釋）的吸收光譜。

根據(jù)268 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算吸附率和解吸率：

式中：A0為0.1 mg/mL樣品液在268 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A1為吸附上清液按1∶10稀釋，在268 nm波長(zhǎng)處的吸光度；A2為解吸液按1∶10稀釋，在268 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.5.3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

稱取1.08g經(jīng)預(yù)處理的D101大孔樹脂于100mL的具塞瓶中，加入1.0mg/mL的樣品液22mL，室溫條件下水浴振蕩，每隔15min測(cè)定一次上清液（按1∶10稀釋）的吸光度，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸附量為縱坐標(biāo)繪制D101大孔樹脂對(duì)樣品液的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

式中：A0為0.1 mg/mL樣品液在268 nm波長(zhǎng)處的吸光度；Ae為吸附上清液按1∶10稀釋，在268 nm波長(zhǎng)處的吸光度；ρ為樣品儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣品液體積/mL；m為樹脂的質(zhì)量/mg。

1.3.6 D101大孔樹脂純化八角茴香葉黃酮

稱取80 g經(jīng)預(yù)處理的D101大孔樹脂，采用濕法裝柱。將質(zhì)量濃度1.0 mg/mL、pH 4樣品液，以2BV/h的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，每隔8 min測(cè)量一次在268 nm波長(zhǎng)處流出液的吸光度，當(dāng)流出液的吸光度為樣品液吸光度的1/10（泄漏點(diǎn)）時(shí)，停止上樣。用2BV蒸餾水洗凈柱內(nèi)殘留樣品液，然后用70%乙醇溶液解吸，解吸液體積3BV、流速2BV/h。

1.3.7 制備色譜純化八角茴香葉黃酮

稱取粗黃酮5.0 g，溶解在100 mL甲醇溶液中，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，用水定容，使其質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL。制備色譜條件：柱填料為12 g Reveleris?RP C18cartridge，流動(dòng)相為5%乙酸溶液（A）和甲醇（B），流速為10 mL/min，進(jìn)樣量為15 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm（UV1）和328 nm（UV2）。梯度洗脫條件為：0～2 min：0～30% B；2～5 min：30%～50% B；5～13 min：50%～70% B；13～15 min：70%～70% B。

1.3.8 純化效果的檢測(cè)

按1.3.6節(jié)和1.3.7節(jié)方法，將經(jīng)大孔樹脂和制備色譜純化的八角茴香葉黃酮溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去醇后，冷凍干燥得純化后的八角茴香葉黃酮粉末。用30%甲醇溶解并稀釋至1 mg/mL，進(jìn)HPLC儀分析。分析條件：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇（A）、水（B）、5%乙酸溶液（C），流速0.8mL/min，進(jìn)樣量15μL。梯度洗脫條件為：0～5min，30%～50% A；5～15min，50%～60% A；15～23min，60%～65% A；23～28min，65%～67% A，C溶液一直維持在10%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Minitab對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Design-Expert對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.3.3節(jié)方法，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=11.591 85C—0.019 25，C為稀釋溶液中蘆丁的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Minitab對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，模型的主效應(yīng)是極顯著的（P＜0.01），證明選取的因素恰當(dāng)。其中有關(guān)微波的3 個(gè)因素中，微波溫度是影響八角茴香葉黃酮提取的極顯著因素（P＜0.01），而微波時(shí)間和微波起始功率都是不顯著影響因素（P＞0.05）。這是因?yàn)槲⒉ㄝo助提取中，微波作用于分子，使分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，溫度升高，破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出。當(dāng)微波溫度一定時(shí)，微波起始功率越大，達(dá)到所需要微波溫度的時(shí)間就越短。同時(shí)，當(dāng)達(dá)到了微波溫度時(shí)，微波合成儀會(huì)根據(jù)所設(shè)定的溫度自動(dòng)調(diào)整功率，即會(huì)在剩下的微波時(shí)間中維持較低的微波功率。因此對(duì)于八角茴香葉黃酮的提取試驗(yàn)中，三者的協(xié)同效應(yīng)表現(xiàn)出來的是微波溫度極顯著，微波起始功率和微波時(shí)間都是不顯著影響因素。因素乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比都是顯著影響因素（P＜0.05），乙醇溶液是黃酮的良好提取劑，適宜體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)于八角茴香葉黃酮會(huì)有更好的溶解性。因此在下一步的響應(yīng)面分析中，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波溫度這3個(gè)主要影響因素。

表 3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)值Table 3 Plackett-Burman design and results

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表 4 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Response surface design and results

用Design-Expert軟件對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，整個(gè)模型是極顯著的（P＜0.01），而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），其中R2=0.983 8，這說明方程擬合良好并且無(wú)其他顯著因素的影響，試驗(yàn)條件是合適的。乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波溫度都是極顯著影響因素（P＜0.01）。二次項(xiàng)中，B2、C2都是極顯著影響因素（P＜0.01）。三因素的交互作用中，乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波溫度是顯著（P＜0.05），液料比和微波溫度是極顯著（P＜0.01）。而乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的交互作用、乙醇體積分?jǐn)?shù)的平方都不是顯著因素（P＞0.01）。

在建立的回歸模型中，以A268nm為響應(yīng)值，分別將乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和微波溫度定為0水平，得到其他兩個(gè)因素的方程，繪制響應(yīng)值與這兩個(gè)因素的三維空間曲面圖。

圖 1 各因素交互作用對(duì)吸光度的影響Fig.1 Effects of interactions of various factors on absorbance

由圖1a可見，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，吸光度增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%附近時(shí)，吸光度達(dá)到最大值。微波提取的溶劑必須滿足兩點(diǎn)：一是溶劑的極性不能太低，二是溶劑對(duì)提取成份有較強(qiáng)的溶解性，且對(duì)后續(xù)操作影響較小[19]。微波加熱的吸收體需要微波吸能物質(zhì)，而極性物質(zhì)是微波的吸能物質(zhì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，此時(shí)溶液的極性較大，吸能較多，許多雜質(zhì)如水溶性的糖類都能被溶解，并且為后續(xù)分離純化黃酮帶來了不利影響。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，雖然吸能會(huì)降低，但是弱極性的黃酮物質(zhì)在此極性下能被充分溶解，從而使吸光度增大。乙醇體積分?jǐn)?shù)的持續(xù)增大，對(duì)微波能的吸收也將持續(xù)減弱，此時(shí)由于能量的減少，分子振動(dòng)減弱，脂溶性的物質(zhì)如葉綠素溶出[20]，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固[21]，多方面的因素都會(huì)影響黃酮的溶出。因此找到一個(gè)合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)是需要兼顧極性和吸能兩方面因素。

隨著液料比的增加，吸光度也隨之增大，液料比是提取過程中的的重要因素，主要影響著固相和液相之間的濃度差，即傳質(zhì)推動(dòng)力[22]。液料比的提高會(huì)在很大程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，當(dāng)比例在27∶1附近時(shí)，吸光度已達(dá)到最大，說明此時(shí)溶劑的量已經(jīng)能充分溶解八角茴香葉中的黃酮，更多的溶液不僅會(huì)使溶液濺失，造成溶劑的浪費(fèi)，也影響了對(duì)微波能的吸收[23]，還會(huì)對(duì)提取罐造成更大的壓力。因此找到一個(gè)合適的液料比是需要考慮溶解黃酮的總量和一定的經(jīng)濟(jì)因素。

由圖1b可見，隨著微波溫度的升高，吸光度明顯增大，并且在75 ℃附近達(dá)到最大值。溫度的升高，意味著加熱和維持微波溫度時(shí)所需要的功率變大，這能促進(jìn)黃酮的溶出。同時(shí)高的溫度會(huì)使溶劑的表面張力和黏性降低，從而使溶劑的滲透力以及對(duì)黃酮的溶解能力的增加。但是溫度的持續(xù)升高，不僅會(huì)造成一些非黃酮類物質(zhì)溶解性增大，還會(huì)使部分黃酮分子在高溫條件下被破壞，使吸光度降低。同時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波溫度的協(xié)同作用中，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，沸點(diǎn)越接近乙醇的沸點(diǎn)（78.4 ℃），因此當(dāng)溫度達(dá)到79 ℃附近時(shí)，能觀察到回流管中有大量的液體，即溶劑已達(dá)到沸點(diǎn)開始劇烈的沸騰，這時(shí)提取罐內(nèi)實(shí)際與八角茴香葉接觸的溶劑變少，影響到了黃酮的浸出。

由圖1c可見，吸光度隨著微波溫度的升高而升高，在高溫時(shí)隨著液料比的增大而增大。液料比和微波溫度的協(xié)同作用體現(xiàn)在微波溫度較高時(shí)，較高的溫度使溶劑的黏性降低，更多的溶劑能滲透進(jìn)植物，此時(shí)較大的液料比就能更充分的溶解黃酮，使吸光度增大。

對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到吸光度A268nm對(duì)三因素的二次多項(xiàng)式回歸方程：A268nm=0.61+ 0.032A+0.036B+0.053C—0.009125AB—0.02AC+0.031BC—0.019A2—0.063B2—0.051C2。通過回歸模型預(yù)測(cè)的八角茴香葉總黃酮最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)66.46%、液料比25.77∶1、微波溫度75.35 ℃、微波起始功率500 W、微波時(shí)間8 min（0～1.5 min，功率為500 W，1.5～8 min，功率自動(dòng)調(diào)整到100W），此條件下A268nm的預(yù)測(cè)值為0.633。考慮可操作性，最佳工藝修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)67%、液料比26∶1、微波溫度75℃。在此條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過3 次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)測(cè)A268nm為0.654，相對(duì)誤差為3.32%，根據(jù)2.1節(jié)中的回歸方程計(jì)算稀釋溶液中黃酮的質(zhì)量濃度ρ，根據(jù)公式（1）計(jì)算黃酮得率為6.97%。證明響應(yīng)面法得到八角茴香葉黃酮的提取條件和模型是真實(shí)可靠的。

2.4 4種樹脂的靜態(tài)吸附與解吸

圖 2 4種大孔樹脂吸附樣品液后上清液的吸收曲線Fig.2 Adsorption curves of fl avonoids onto 4 kinds of macroporous resins

如圖2所示，吸收曲線1～5分別代表D101、AB-8、NKA-9、聚酰胺大孔樹脂吸附樣品液和0.1 mg/mL樣品溶液。D101、AB-8、NKA-9大孔樹脂對(duì)于八角葉黃酮溶液的吸附率都達(dá)到了80%，說明這3 種樹脂對(duì)其有較好的吸附作用，而聚酰胺的吸附率只有50.01%。

圖 3 4種大孔樹脂乙醇洗脫液的吸收曲線Fig.3 Desorption curves of fl avonoids from 4 kinds of macroporous resins with aqueous ethanol

如圖3所示，吸收曲線1～5分別代表0.1 mg/mL樣品溶液和D101、AB-8、NKA-9、聚酰胺樹脂乙醇洗脫液，大孔樹脂對(duì)于吸附上的八角葉黃酮都有很好的解吸率，解吸率都在95%以上，說明這4種樹脂吸附黃酮后，都能很好的被解吸。

按公式（2）、（3）計(jì)算4 種大孔樹脂的吸附率和解吸率，結(jié)果見表5。

表 5 4種大孔樹脂的吸附率和解吸率Table 5 Adsorption and desorption rates of fl avonoids by 4 kinds of macroporous resins

黃酮類化合物有較多的酚羥基和糖苷鏈，有一定的極性和親水性，生成氫鍵的能力較強(qiáng)，有利于吸附到極性以及弱極性的大孔樹脂表面及孔內(nèi)[24]。同時(shí)大孔樹脂的吸附能力還和比表面積有關(guān)，在孔徑相差不大的情況下，比表面積越大，吸附能力越強(qiáng)。因此，綜合吸附率和解吸率等條件，選用D101吸附樹脂純化八角茴香葉黃酮。

2.5 D101吸附樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

圖 4 D101大孔樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Kinetic curve for static adsorption of D101 macroporous resin

由圖4可知，D101是快速吸附型樹脂，0～15 min內(nèi)，黃酮的吸附量隨時(shí)間延長(zhǎng)快速增長(zhǎng)。15～45 min內(nèi)逐漸達(dá)到最大值，45～120 min內(nèi)是樹脂與溶液的平衡階段。根據(jù)公式（4）計(jì)算可得D101對(duì)八角茴香葉黃酮的最大吸附量為16.67 mg/g。

2.6 大孔樹脂和制備色譜純化效果分析

根據(jù)1.3.7節(jié)方法，得到經(jīng)制備色譜純化后的八角茴香葉黃酮，得到的色譜圖見圖5，圖中AB線代表B溶劑在流動(dòng)相中的比例。

圖 5 制備色譜純化八角茴香葉黃酮（UV1=268 nm，UV2=328 nm）Fig.5 Purifi cation of fl avonoids from Illicium verum leaves by preparative chromatography (UV1= 268 nm, UV2= 328 nm)

由圖5可以看出，兩個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)條件下峰形是重合的，制備色譜將八角茴香葉黃酮分為4個(gè)組分：1.6～1.8 min為組分1，5.8～7.1 min為組分2，7.1～10.7 min為組分3，10.7～13.3 min為組分4。

圖 6 D101大孔樹脂和制備色譜純化八角茴香葉黃酮的HPLLCC圖Fig.6 HPLC profi les of fl avonoids from Illicium verum leaves purifi ed by D101 resin and preparative chromatography

圖6 色譜圖1為經(jīng)D101大孔樹脂純化后的1.0 mg/mL八角茴香葉總黃酮，圖中色譜圖2～5分別為組分1、2、3和4。經(jīng)大孔樹脂純化得到的八角茴香葉黃酮的色譜圖1與制備色譜分別得到的4 個(gè)組分的色譜圖2～5能一一對(duì)應(yīng)。色譜圖2對(duì)應(yīng)色譜圖1的2.5～5 min和14 min的峰形，色譜圖3對(duì)應(yīng)色譜圖1的前12 min的峰形，色譜圖4對(duì)應(yīng)色譜圖1的14、18 min和22 min的峰形，色譜圖5對(duì)應(yīng)色譜圖1的后14～23 min的峰形，并且在質(zhì)量濃度都為1.0 mg/mL的情況下，組分1～4的響應(yīng)值都比色譜圖1高出許多，約為1.6倍。這說明制備色譜純化八角茴香葉黃酮不僅不會(huì)丟失成份，而且還能對(duì)總黃酮進(jìn)行粗分并且每一組分的純度都得到了提高。D101大孔樹脂純化250 mg八角茴香葉黃酮，需要4 h，平均1 h只能純化62.5 mg，從裝柱到上樣、洗脫、重新裝柱等都必須人工操作和檢測(cè)。制備色譜一次能上樣150 mg，制備所需時(shí)間僅為15 min，加上清洗、接樣共計(jì)25 min，平均1 h能純化360 mg。由此，制備色譜比大孔樹脂具有高效快速的優(yōu)勢(shì)[25]。

3 結(jié) 論

通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選關(guān)鍵因素，通過響應(yīng)面分析法確定最優(yōu)組合，得到了八角茴香葉黃酮提取的最佳條件。同時(shí)使用D101大孔樹脂和制備色譜純化了八角茴香葉黃酮，對(duì)比兩種純化方式，制備色譜不僅能夠高效快速的純化八角茴香葉黃酮，并且能對(duì)黃酮進(jìn)行粗分得到4種組分，為其進(jìn)一步的成分分析及生物活性的研究奠定了基礎(chǔ)，為八角茴香葉黃酮的開發(fā)與應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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Microwave Extraction and Purifi cation of Flavonoids from Illicium verum Leaves

LIU Tao, LI Rong*, ZHANG Lujie, JIANG Zitao
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The conditions for microwave-assisted extraction of fl avonoids from Illicium verum l eaves were optimized by the combined use of Plackett-Burman design and response surface methodology (RSM) as follows: ethanol concentration, 67%; ratio of solvent to solid, 26:1; extraction temperature, 75 ℃; initial microwave power, 500 W; and extraction time, 8 min. The yield of total fl avonoids was 6.97% under these conditions. The fl avonoids from I. verum leaves were purifi ed by D101 macroporous resin in comparison with preparative chromatography. The results indicated that preparative chromatography is not only an efficient and rapid method for the purification of flavonoids extract, but also can preliminarily separate fl avonoids.

Illicium verum leaves; response surface; macroporous resins; preparative chromatography

TS202.3

A

1002-6630（2015）02-0030-06

10.7506/spkx1002-6630-201502006

2014-05-22

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（12JCZDJC34100）

劉韜（198 9—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：411698992@qq.com

*通信作者：李榮（1962—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称芳疤砑觿┓治?。E-mail：lirong@tjcu.edu.cn