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        響應(yīng)面法優(yōu)化甘蔗梢提取物中花青素的分離工藝

        2015-12-10 06:00:36李新瑩
        食品科學(xué) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:面法大孔花青素

        李新瑩,姚 舜

        (1.西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院,四川 成都 610041;2.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,四川 成都 610065)

        響應(yīng)面法優(yōu)化甘蔗梢提取物中花青素的分離工藝

        李新瑩1,姚 舜2

        (1.西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院,四川 成都 610041;2.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,四川 成都 610065)

        在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過中心組合試驗設(shè)計原理,運用響應(yīng)面法優(yōu)化甘蔗梢提取物中花青素成分的綜合分離工藝條件。以pH值、洗脫體積和流速為考察因素,進行三因素三水平試驗,并獲得多元二次回歸方程。結(jié)果表明,采用大孔吸附樹脂從甘蔗梢提取物中分離花青素成分的最佳工藝條件為:將提取浸膏用蒸餾水溶解后調(diào)節(jié)pH值為5.51,然后以大孔樹脂與提取物干質(zhì)量之比20∶1上樣,通過裝填有D141型大孔吸附樹脂的層析柱,用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液以1.59 BV/h流速、3.76 BV洗脫體積洗脫。該條件下花青素含量為91 mg/kg,與理論值接近。

        響應(yīng)面法;甘蔗梢;花青素;分離

        響應(yīng)面分析法是由Box等于20世紀(jì)50年代提出的一種優(yōu)化工藝條件的有效方法,該方法具有實驗周期短、得到的回歸方程精度高、可研究多因素間交互作用等優(yōu)點[1-2],已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物提取、藥物合成以及微生物培養(yǎng)等工藝參數(shù)的優(yōu)化[3-14]。甘蔗梢作為制糖工業(yè)原料前處理工段的廢棄物,除了被用作飼料或肥料以外大部分都被丟棄,未得到充分利用。然而,近年來的研究表明,甘蔗中除了含有大量糖以外,還擁有一定數(shù)量以花青素為代表的天然活性成分資源[15]。花青素是一種良好的抗氧化活性劑,具有抗腫瘤、抗炎以及保護心血管等生理作用[16-22]。甘蔗梢是獲得花青素的有效資源,但目前關(guān)于從制糖工業(yè)廢棄物甘蔗梢中提取分離花青素類抗氧化活性成分的研究鮮有報道,主要集中在甘蔗汁、甘蔗渣發(fā)酵生成醇類或提取纖維素和色素等方面。由于甘蔗梢粗提物中含有較多雜質(zhì),花青素含量相對較低,因此需要進一步分離純化。大孔樹脂吸附法是天然產(chǎn)物成分分離純化的常用方法之一,已廣泛應(yīng)用于生化物質(zhì)的選擇性分離[23-26]。本實驗對大孔吸附樹脂分離甘蔗梢提取物中花青素成分的分離工藝進行研究,通過中心組合試驗設(shè)計(central composite design,CCD)原理,運用響應(yīng)面法對分離過程參數(shù)進行優(yōu)化,以期獲得最佳的花青素分離工藝條件,為實現(xiàn)制糖工業(yè)廢棄資源的深度開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        甘蔗梢樣品采自四川省攀枝花市米易縣,經(jīng)四川華森糖業(yè)股份有限公司李玉德高級工程師鑒定被子植物門單子葉植物綱禾本目禾本科甘蔗屬植物,所有樣品于4℃以下運輸及保藏。

        矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside)標(biāo)準(zhǔn)品 成都曼斯特 生物科技有限公司;D141大孔吸附樹脂 中藍晨光化工研究院;無水乙醇、正丁醇、鹽酸等均為國產(chǎn)分析純;超純水 美國Millipore公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        TU1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;FA/JA型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;FW135萬能高速粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-50DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司;GM-0.33II型隔膜真空泵 天津騰達過濾器件廠;DZF-2B型電熱真空干燥箱 北京永光明醫(yī)療儀器廠;RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 分離工藝路線

        將甘蔗梢粉碎后,以乙醇為提取溶劑,超聲波輔助提取3 次,收集多次提取液,濃縮至干,加水溶解,調(diào)節(jié)上樣液pH值后將其通過裝填有大孔吸附樹脂的層析柱,待充分吸附后,先用蒸餾水洗脫,此部位主要為蔗糖;再用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液進行洗脫,收集30%乙醇洗脫液,得到花青素部位,按照1.3.2節(jié)中方法計算花青素的含量。甘蔗梢中花青素成分分離工藝路線如圖1所示。

        圖 1 甘蔗梢中花青素分離工藝路線Fig.1 Scheme for separation of anthocyanins from sugarcane tips

        1.3.2 花青素含量測定

        1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻[27-28]:精密稱取66.0mg的cyanidin-3-O-glucoside標(biāo)準(zhǔn)品,用pH 2的正丁醇-鹽酸溶液溶解于100mL容量瓶中,定容至100 mL,充分搖勻,得到質(zhì)量濃度為660.0 mg/L的cyanidin-3-O-glucoside對照品儲備溶液,備用。分別精密吸取上述對照品儲備溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、1.0 mL置于10 mL容量瓶中,用pH 2的正丁醇-鹽酸溶液定容至刻度,搖勻,于95 ℃水浴中冷凝回流40min,迅速在冷水中將其冷卻到室溫。以空白為對照,使用紫外-可見分光光度儀在516 nm波長處測定不同質(zhì)量濃度溶液的吸光度,再以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、吸光度為縱坐標(biāo)(Y),繪制出總花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到相關(guān)回歸方程。

        1.3.2.2 花青素含量測定

        將柱層析后收集的30%乙醇洗脫液濃縮至干,用pH 2的正丁醇-鹽酸溶液溶解,于95 ℃水浴中冷凝回流40min,迅速在冷水中將其冷卻到室溫。以空白為對照,使用紫外-可見分光光度儀在516 nm波長處測定溶液的吸光度,通過回歸方程計算花青素含量,見式(1)。

        1.3.3 單因素試驗

        以前期研究為基礎(chǔ)進行單因素試驗,分別考察了pH值、洗脫體積、流速等因素對甘蔗梢中花青素分離效果的影響。每次取一定量的甘蔗梢提取物(相當(dāng)于1 000 g甘蔗梢原料提取得到)裝入填有D141型大孔吸附樹脂的層析柱中,分別以不同pH值(pH 1、3、5、7、9)上樣,按提取物與樹脂干質(zhì)量比1∶20上樣,充分吸附后,先用蒸餾水洗脫,再用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液進行洗脫,按不同洗脫體積(1、2、3、4、5 BV)和流速(1、2、3、4、5 BV/h)收集乙醇洗脫液,按照1.3.2節(jié)方法計算花青素的含量,并通過含量確定活性成分分離的最佳單因素條件。

        1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化

        花青素分離過程根據(jù)CCD原理,運用Design-Expert 7.1.3軟件,在單因素試驗的基礎(chǔ)上分別考察了對提取量影響較大的pH值、洗脫體積、流速對花青素分離過程的影響,以pH值(X1)、洗脫體積(X2)、流速(X3)3 個因素為自變量,分別代表了5 個水平編碼(—1.68、—1、0、1、1.68),共20個試驗點。以花青素含量為響應(yīng)值設(shè)計了三因素三水平試驗,20 個試驗點的響應(yīng)面分析試驗分為14 個析因點和6 個零點,試驗因素與水平設(shè)計如表1所示。

        表 1 花青素分離過程中心組合設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in central composite design for anthocyanins separation

        試驗以隨機次序進行,每組試驗進行3 次平行操作,計算得到平均響應(yīng)值通過程序分析,得出響應(yīng)面分析圖、回歸擬合方程以及方差分析表,同時通過Design-Expert軟件中的程序?qū)υ囼灲Y(jié)果進行響應(yīng)面分析,經(jīng)二次回歸擬合后求得響應(yīng)函數(shù),運用公式(2)得出回歸方程。

        式中:Xi、Xj為獨立編碼變量;β0為截距的衰減系數(shù);βj為一次相的衰減系數(shù);βjj為二次相的衰減系數(shù);βij為交互相的衰減系數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗結(jié)果

        圖 2 pH值對洗脫液中花青素含量的影響Fig.2 Effect of sample pH on the anthocyanins content

        2.1.1 pH值對分離效果的影響調(diào)節(jié)上樣液pH值分別為1、3、5、7、9,以洗脫體積和流速分別為3 BV和2 BV/h進行柱層析后,通過花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(Y=0.000 7X+0.007 9,R2=0.999 6)檢測洗脫液中花青素含量。由圖2可以看出,在洗脫體積和流速一定的條件下,隨著pH值的升高,花青素含量先增大后減小,且pH 5時花青素成分含量最高,當(dāng)pH值大于7后洗脫液中花青素含量呈下降趨勢,說明弱酸性條件更利于花青素成分的吸附及分離,因此選擇pH 5為最佳條件。

        2.1.2 洗脫體積對分離效果的影響

        圖 3 洗脫體積對洗脫液中花青素含量的影響Fig.3 Effect of elution volume on the anthocyanins content

        選用不同的洗脫體積(1、2、3、4、5 BV),上樣液pH 5、流速2 BV/h條件下進行柱層析,檢測洗脫液中花青素含量,考察不同洗脫體積對甘蔗梢提取物中花青素分離效果的影響。由圖3可以看出,在pH值和流速一定的條件下,隨著洗脫體積的升高,花青素含量是逐漸增大的,當(dāng)洗脫體積超過3 BV后花青素的洗脫量基本沒有變化,再增加洗脫體積對花青素洗脫量的提高影響不顯著,考慮到洗脫溶劑量過多會增加后續(xù)濃縮的負擔(dān),因此選擇洗脫體積為3 BV最佳。

        2.1.3 流速對分離效果的影響

        圖 4 流速對洗脫液中花青素含量的影響Fig.4 Effect of elution fl ow rate on the anthocyanins content

        選用不同的洗脫流速(1、2、3、4、5 BV/h),上樣液pH 5、洗脫體積3 BV條件下進行柱層析,檢測洗脫液中花青素含量,考察不同流速對甘蔗梢提取物中花青素分離效果的影響。由圖4可以看出,在pH值和洗脫體積一定的條件下,隨著流速的升高,花青素含量先增大后減小,當(dāng)流速超過2 BV/h后花青素含量反而減小,且花青素含量減小的趨勢較為明顯,說明流速過快不利于花青素成分的分離,因此選擇2 BV/h為最佳流速。

        2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

        選擇pH值、洗脫體積和流速為自變量,考察了各因素對花青素分離過程的影響,響應(yīng)面分析方案與結(jié)果如表2所示。通過多項式回歸分析對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到了花青素含量與各因素變量間的多項式方程:

        為了說明回歸方程的有效性及各因素對分離得到花青素量的影響程度,對回歸方程進行了方差分析。由表3可以看出,流速(X3)對大孔吸附樹脂分離花青素有較為顯著的影響;洗脫體積的影響不顯著(P>0.05)。二次項中的pH值和流速對大孔吸附樹脂分離花青素的影響達到極顯著的水平(P<0.000 1);交互項中pH值和流速(X1X3)對大孔吸附樹脂分離花青素影響達到極顯著水平(P<0.000 1),其余交互項對分離無影響。此模型的決定系數(shù)R2為0.960 1,經(jīng)擬合檢驗可知,差異極顯著(P<0.000 1),表明該方程對試驗擬合情況良好,誤差小,能夠正確反映大孔吸附樹脂分離甘蔗梢花青素與pH值、洗脫體積、流速之間的關(guān)系;失擬項不顯著(P>0.05),說明本試驗無其他因素的顯著影響,可以用此模型對大孔吸附樹脂分離花青素進行分析和預(yù)測,模型是有效的。

        表 2 花青素分離響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果Table 2 Central composite design and response values for anthocyanins separation

        圖 5 pH值和洗脫體積對大孔吸附樹脂分離甘蔗梢花青素影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot showing effects of sample pH and elution volume as well as their interaction on the anthocyanins content

        圖 6 pH值和流速對大孔吸附樹脂分離甘蔗梢花青素影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot showing effects of sample pH and elution fl ow rate as well as their interaction on the anthocyanins content

        圖 7 洗脫體積和流速對大孔樹脂分離甘蔗梢花青素影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot showing effects of elution volume and elution fl ow rate as well as their interaction on the anthocyanins content

        如圖5所示,等高線可以直觀地看出兩因素交互作用顯著,當(dāng)洗脫體積一定時,分離得到花青素的量隨pH值的增加而增加,當(dāng)pH值超過5時,花青素含量隨pH值的增加而減小。如圖6所示,等高線可以直觀地看出兩因素交互作用顯著,隨著pH值和流速的增加,大孔吸附樹脂分離得到花青素含量先增大后緩慢減少。在pH 5、流速2 BV/h附近時,大孔吸附樹脂分離得到花青素含量達到最大值。如圖7所示,等高線可以直觀地看出兩因素交互作用顯著,當(dāng)洗脫體積一定時,隨著流速的增加,大孔吸附樹脂分離得到花青素含量先增大后緩慢減小,在洗脫體積3 BV、流速2 BV/h附近時,大孔吸附樹脂分離得到花青素含量達到最大值,且分離得到花青素的量對流速的變化比對洗脫體積的變化敏感。

        根據(jù)所得到的模型,結(jié)合統(tǒng)計軟件分析可以預(yù)測在穩(wěn)定狀態(tài)下甘蔗梢中花青素的最佳分離條件為pH 5.51、洗脫體積3.76 BV、流速1.59 BV/h,在此條件下理論上花青素含量應(yīng)為92 mg/kg。為了驗證模型方程的合適性和有效性,在試驗水平范圍內(nèi),進行了最佳花青素分離條件的驗證實驗,結(jié)果表明,大孔吸附樹脂分離得到花青素含量為91 mg/kg,與理論值相近,證明此模型是合理有效的,具有較好的實踐指導(dǎo)意義。

        3 結(jié) 論

        本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化了甘蔗梢中花青素類成分的分離工藝條件,分別考察了pH值、洗脫體積、流速等因素對甘蔗梢中花青素成分分離效果的影響,并得到從甘蔗梢中分離花青素成分的最佳工藝條件為:調(diào)節(jié)上樣液pH 5.51,以大孔樹脂與提取物干質(zhì)量之比20∶1上樣,通過裝填有D141型大孔吸附樹脂的層析柱,先用蒸餾水洗脫后,再用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液以1.59 BV/h流速、3.76 BV洗脫體積來進行洗脫。該條件下花青素含量為91 mg/kg,與理論值相近。本實驗將為進一步制備較高純度花青素單體奠定基礎(chǔ),以期為制糖工業(yè)廢棄物的深度開發(fā)和綜合利用提供參考。

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        Optimizing Conditions for Separation of Anthocyanins from Sugarcane Tip Extracts Using Response Surface Methodology

        LI Xinying1, YAO Shun2
        (1. College of Chemistry and Environment Protection Engineering, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 2. School of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China)

        A central composite design was used to investigate the best conditions for separation of anthocyanins from sugarcane tip extracts. In the separation procedure, the independent variables studied were pH value, elution volume, and fl ow rate. Using anthocyanins content as the response variable, a multivariable quadratic regression equation was developed. The optimal separation conditions for anthocyanins from sugarcane tip extracts were determined as follows: the extract was distilled with water followed by pH adjustment to 5.51 and loaded onto a column packed with D141-type resin with a resin-to-extract (dry weight) ratio of 20:1, and then the column was eluted with 3.76 BV of 30% aqueous ethanol at a fl ow rate of 1.59 BV/h. The anthocyanins content of the purifi ed product obtained was 91 mg/kg, which was similar to the predicted value.

        response surface methodology; sugarcane tips; anthocyanins; separation

        TS249;O629

        A

        1002-6630(2015)02-0007-05

        10.7506/spkx1002-6630-201502002

        2014-06-21

        國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(81102344);國家自然科學(xué)基金面上項目(81373284)

        李新瑩(1984—),女,講師,博士,研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail:lixinying1984@163.com

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