郭雙雙，楊利民，張一鳴，楊 莉，韓 梅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

微波輔助萃取人參總皂苷與單體皂苷含量分析

郭雙雙，楊利民*，張一鳴，楊 莉，韓 梅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)微波輔助萃取人參皂苷的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，采用分光光度法和高效液相色譜法對(duì)萃取物中的人參總皂苷及8 種單體皂苷進(jìn)行測(cè)定，考察不同提取條件下所得人參皂苷產(chǎn)率和組成的差異。結(jié)果表明：1）以總皂苷為提取目標(biāo)時(shí)，最佳提取條件為萃取功率600 W、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間5 min、料液比1∶20，萃取3 次；2）以8 種單體皂苷為提取目標(biāo)時(shí)，最佳提取條件為萃取功率300 W、萃取溫度35 ℃、萃取時(shí)間15 min、料液比1∶25，萃取3 次（提取率為0.98%）；3）在最佳提取條件下，以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇為提取溶劑時(shí)，總皂苷提取率為6.02%，而單體皂苷提取率之和為0.43%；以水飽和正丁醇為提取溶劑時(shí)8 種單體皂苷提取率達(dá)到0.71%。綜上所述，人參質(zhì)量評(píng)價(jià)和工藝優(yōu)化結(jié)果與提取方法、提取條件、評(píng)價(jià)指標(biāo)密切相關(guān)。

組成分析；質(zhì)量評(píng)價(jià)；單體皂苷；正交試驗(yàn)；高效液相色譜法

人參（Panax ginseng C.A. Mey）為五加科多年生宿生植物，是傳統(tǒng)的名貴藥材。2012年衛(wèi)生部批準(zhǔn)人參（人工種植）為新資源食品，為人參在食品中應(yīng)用給予科學(xué)的支持與肯定[1]。人參中所含化學(xué)成分包括人參皂苷、糖類、氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)酸、脂溶性成分以及微量元素等[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，人參皂苷是人參中最為重要的一類生理活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善心血管及造血系統(tǒng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、提高免疫力、抗疲勞作用以及抗癌等作用，目前，人參中已發(fā)現(xiàn)單體皂苷40多種[3]，其含量約占人參干質(zhì)量的4%[4]，而人參主根中總皂苷含量約占干質(zhì)量的2.0%～7.0%。

人參總皂苷和單體皂苷的生理活性研究一直都是活躍的研究領(lǐng)域，不同的人參皂苷都有其獨(dú)特的生理功能，甚至某些人參單體成分藥理作用截然相反[3]，如人參總皂苷是否具有溶血活性常因所用原料、提取方法及提取條件不同導(dǎo)致結(jié)論完全相反。這些成分在制劑中差別較大，勢(shì)必會(huì)影響療效，因此，發(fā)展標(biāo)準(zhǔn)化的人參標(biāo)準(zhǔn)提取物是有必要的[5]。單體皂苷作用不同，單體化合物制劑也是一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。

人參皂苷的傳統(tǒng)提取方法有煎煮法、浸漬法、滲濾法、回流法、連續(xù)回流提取法、索氏提取法等[6]。近年來，一些新的提取技術(shù)不斷應(yīng)用于人參及人參皂苷提取的研究中，如超聲提取法、超臨界流體提取法、微波輔助提取法等[7-11]。微波輔助提取法是將微波技術(shù)與傳統(tǒng)的溶劑提取法結(jié)合后形成的一種提取方法，具有萃取時(shí)間短、萃取效率高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于人參植物中人參皂苷的提取，但仍存在萃取溫度、萃取時(shí)間、提取料液比等方面的問題，限制了微波輔助提取技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。

針對(duì)上述問題，本實(shí)驗(yàn)對(duì)人參皂苷的微波輔助提取工藝進(jìn)行研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法對(duì)微波輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化?，F(xiàn)已有多種分析方法被用于人參植物原料、提取物以及人參產(chǎn)品中人參皂苷定性和定量分析[12-17]，本實(shí)驗(yàn)分別利用分光光度法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定人參中總皂苷含量和人參中8 種主要皂苷單體Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rf、Rb3，研究同一提取方法不同提取條件總皂苷與單體皂苷之間差異程度，為安全、高效、簡(jiǎn)捷地提取目標(biāo)單體人參皂苷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生曬參（主根）吉林省集安地區(qū)人工種植5 a人參；人參單體皂苷對(duì)照品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd及人參總皂苷對(duì)照品Re（純度≥98%） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Fisher Scientifi c公司；甲醇（萃取劑）等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；MARS5微波萃取儀 美國(guó)CEM公司；6202高速粉碎機(jī) 原鑫田欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司；AUY220電子天平、UV-1700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；DL-820E智能超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；SHZ-95A循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波萃取人參皂苷單因素考察

將過篩后（40 目）的人參主根粉末，放入乙醚中浸泡3 h（1∶20（g/mL）），除去脂溶性雜質(zhì)后過濾，將粉末60 ℃烘干備用。稱取1 g人參粉末放入萃取罐，按照設(shè)定的條件進(jìn)行提取、過濾、減壓濃縮，濃縮液定容至25 mL備用。

通過控制單一變量的方法，分別對(duì)不同萃取時(shí)間、萃取溫度、萃取功率、萃取次數(shù)、萃取溶劑和料液比進(jìn)行考察。微波提取條件為料液比1∶30（g/mL）、萃取時(shí)間15 min、萃取溫度50 ℃、萃取功率600 W、萃取次數(shù)3 次，以人參總皂苷提取率為考察指標(biāo)，考察各個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響。單因素梯度分別設(shè)置為萃取溶劑（水、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、體積分?jǐn)?shù)80%甲醇、水飽和正丁醇）；萃取次數(shù)（1、2、3、4 次）；萃取溫度（35、40、45、50、60 ℃）；萃取時(shí)間（3、5、10、15、20 min）；料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶35）。

1.3.2 微波萃取條件的優(yōu)化

為全面考察微波萃取中各因素的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。稱取人參原料1 g，以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇為萃取劑，提取3 次。以萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取功率和料液比為考察因素，以人參總皂苷的提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，確定微波萃取人參皂苷的最佳工藝條件，試驗(yàn)的各因素水平見表1。

表 1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

1.3.3 分光光度法測(cè)定人參總皂苷

利用香草醛-硫酸比色法[18]測(cè)定人參總皂苷。

1.3.4 人參皂苷單體的HPLC測(cè)定

1.3.4.1 色譜條件

表 2 梯度洗脫表Table 2 Mobile phase composition for gradient elution

Agilent ZORBAX-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B）梯度洗脫；洗脫條件見表2；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取8 種單體人參皂苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd分別為0.25、0.25、0.2、0.25、0.2、0.2、0.125、0.2 mg的對(duì)照品混合溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.3.4.3 線性關(guān)系的考察

精密吸取對(duì)照品溶液3、6、9、12、15、18 μL按1.3.4.1節(jié)色譜條件分別進(jìn)樣，以所測(cè)得物質(zhì)平均峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，見表3。

表 3 人參單體皂苷的回歸方程Table 3 Regression equations with correlation coeffi cients of 8 ginsenoside monomers

1.3.4.4 樣品的測(cè)定

將1.3.1節(jié)所定容的25 mL提取物，過0.22 μm的濾膜，按照1.3.4.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上述8 種人參皂苷單體的提取率（提取率即提取物中皂苷質(zhì)量占樣品總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)）采用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)在相同的條件下平行3 次，以降低實(shí)驗(yàn)操作過程所產(chǎn)生的誤差，數(shù)據(jù)均以±s表示，利用SPSS 17.0方差分析對(duì)組間和組內(nèi)差異進(jìn)行比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助萃取人參皂苷單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同萃取溶劑的影響

由圖1可以看出，以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇作萃取劑時(shí)，人參皂苷提取率最高，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取率僅次于甲醇，且與其他萃取劑之間存在顯著差異（P＜0.05），水為提取劑時(shí)人參皂苷提取率最低。

圖 1 萃取溶劑對(duì)人參皂苷提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvents on the yield of ginsenosides

2.1.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖 2 微波輔助提取單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Single factor experimental results of microwave-assisted extraction

由圖2可知，微波輔助提取人參總皂苷各個(gè)單因素的最佳水平分別為萃取次數(shù)為3 次、料液比1∶30、萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間5 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

按照表4進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)不同因素水平的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表5所示。根據(jù)表4中的R值，可以看出各因素對(duì)微波輔助萃取人參皂苷提取率的影響程度依次為B＞D＞C＞A，即萃取功率的影響最大，其次分別為料液比、萃取溫度、萃取時(shí)間。由表5的方差分析結(jié)果可知，萃取時(shí)間、萃取溫度、料液比和萃取功率均對(duì)人參皂苷提取率的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），說明影響人參皂苷提取率的4 個(gè)因素變化都很敏感。

表 4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 4 Results of L9(34) orthogonal array design and range analysis

表 5 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance of the orthogonal array design

根據(jù)極差分析結(jié)果，確定微波輔助萃取人參皂苷的最佳理論條件為萃取功率600 W、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間5 min、料液比1∶20，以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇為萃取劑萃取3 次。在最佳理論條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總皂苷提取率為6.02%。

2.3 微波輔助萃取人參皂苷HPLC組成分析

2.3.1 最佳理論條件下組成分析

分別對(duì)Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 8 種人參單體皂苷進(jìn)行測(cè)定，含量依次為0.263%、0.096%、0.052%、0.144%、0.050%、0.039%、0.000%、0.013%。按照含量從大到小排序?yàn)椋篟g1＞Rb1＞Re＞Rf＞Rc＞Rb2＞Rd＞Rb3。這8 種皂苷是人參中含量較豐富的幾種皂苷，常作為評(píng)價(jià)人參質(zhì)量和鑒定人參標(biāo)準(zhǔn)。其中Rg1提取率最高，其次是Rb1和Re，文獻(xiàn)中報(bào)道人參皂苷Rg1具有促進(jìn)中樞神經(jīng)興奮、抗疲勞、改善記憶、促進(jìn)DNA和RNA合成等作用；人參皂苷Rbl對(duì)提高記憶具有促進(jìn)作用，還具有促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、增強(qiáng)第2信使活性等作用；而人參皂苷Re具有抑制中樞神經(jīng)、促進(jìn)刺激腎皮質(zhì)荷爾蒙分泌作用。這與樊紅秀等[19]超臨界萃取人參皂苷及HPLC分析Rb1的提取率較高相關(guān)，其次為Rg1和Re結(jié)果基本一致。

2.3.2 不同提取劑組成分析

表 6 不同提取劑微波萃取人參皂苷組成分析Table 6 Effect of different extraction solvents on ginsenoside composition

由表6可知，用不同提取劑萃取所得8 種單體皂苷含量按大小排序。利用SPSS分析可知8 種單體皂苷含量之間存在顯著差異。以水飽和正丁醇作提取劑時(shí)，除Re外其他7 種單體皂苷提取率均最高，并且8 種皂苷總和仍然最高。水和體積分?jǐn)?shù)70%乙醇做萃取劑時(shí)僅Rg1、Rb3、Rd 3 種皂苷存在顯著差異，其他5 種皂苷含量一樣。當(dāng)以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇為萃取劑時(shí)，8 種單體皂苷的提取率均處于最低水平，且Rb3、Rd未被檢測(cè)到。與2.1.1節(jié)結(jié)果不符，說明雖然體積分?jǐn)?shù)80%甲醇作為提取劑總皂苷提取率高，但是這8 種常見皂苷含量較低，可能是微波輔助提取過程中皂苷被分解成次級(jí)皂苷。人參中含量較高的人參皂苷有Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd等，一些在人參中含量極低的人參皂苷被稱為次級(jí)人參皂苷或稀有人參皂苷。研究結(jié)果表明，一些次級(jí)人參皂苷具有很強(qiáng)的藥理活性，如人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、抗腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等作用，人參皂苷Rh1也具有抗癌的功效等。王玉堂等[20-21]分別對(duì)人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行高壓微波降解，從而確定人參提取液中各次級(jí)人參皂苷的來源。壓力600 kPa、時(shí)間10 min條件下6 種人參單體皂苷均完全降解，主要產(chǎn)物為一些中低極性產(chǎn)物。

2.3.3 不同因素水平間的組成分析

由表7可知，正交試驗(yàn)9 個(gè)水平萃取所得8 種單體皂苷含量按大小排序，與表6結(jié)果基本一致。但同1 種人參單體皂苷在不同提取條件下存在顯著差異。由此可知8 種常見人參單體皂苷在人參主根中含量存在顯著差異，且當(dāng)改變提取條件時(shí)，對(duì)同一種人參單體皂苷的提取率存在顯著影響，但對(duì)8 種人參皂苷提取率排序無顯著影響。

分別以8 種單體皂苷提取率之和、三醇型提取率、二醇型提取率、總皂苷提取率為指標(biāo)，分別進(jìn)行極差分析，所得結(jié)果如表8所示。

表 7 L9（34）正交試驗(yàn)HPLC結(jié)果Table 7 Results of L9(34) orthogonal array design

表 8 正交試驗(yàn)以不同指標(biāo)進(jìn)行極差分析結(jié)果Table 8 Results of range analysis for different indexes

由表8可知，選擇不同指標(biāo)時(shí)，所得的結(jié)果存在很大差異。說明當(dāng)提取條件發(fā)生改變時(shí)，各單體皂苷含量會(huì)發(fā)生很大變化。目前中國(guó)藥典中以人參皂苷Rg1和Re的含量作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[22]，但很多生產(chǎn)企業(yè)由于技術(shù)力量及檢測(cè)設(shè)備等存在缺陷，仍有大部分地區(qū)以總皂苷含量作為質(zhì)控的主要指標(biāo)，其中的差異應(yīng)予以重視。有必要研究以不同皂苷含量為指標(biāo)，并且人參質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果與選擇的結(jié)果密切相關(guān)[23]，研究同種提取方法相同條件下，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析，建立合理統(tǒng)一的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，不僅可以規(guī)范人參質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，而且可以獲得更多的目標(biāo)成分。

3 結(jié) 論

皂苷類物質(zhì)是人參中主要的活性物質(zhì)，根據(jù)皂苷元的結(jié)構(gòu)，人參皂苷可分為二醇型、三醇型和齊墩果酸型，每種類型中又包括多種單體皂苷。目前研究顯示，人參總皂苷含量、不同類型人參皂苷含量或單體人參皂苷含量均可作為人參品質(zhì)評(píng)價(jià)的指標(biāo)[24]。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，以總皂苷為指標(biāo)時(shí)，微波輔助提取最佳條件為萃取功率600 W、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間5 min、料液比1∶20，以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇為萃取劑萃取3 次，以8 種單體皂苷提取率之和為指標(biāo)時(shí)，微波輔助最佳提取最佳條件為萃取功率300 W、萃取溫度35 ℃、萃取時(shí)間15 min、料液比1∶25，以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇為萃取劑萃取3 次。通過對(duì)8 種單體皂苷研究發(fā)現(xiàn)，不同提取條件下8 種單體皂苷的大小順序基本無變化，說明這8 種單體皂苷在人參主根中含量差別很大。另外，當(dāng)以總皂苷為指標(biāo)時(shí)，以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇作萃取劑最好與張晶等[25]研究不同，甲醇提取提取率最高只是在實(shí)驗(yàn)室得到的理論值，但在實(shí)際的生產(chǎn)中還是要考慮采用乙醇。而以8 種單體皂苷提取率之和為指標(biāo)時(shí)，以水飽和正丁醇為萃取劑最好，體積分?jǐn)?shù)80%甲醇提取率最次。體積分?jǐn)?shù)70%乙醇對(duì)總皂苷和單體皂苷的提取效果都比較穩(wěn)定，在食品或藥品原料制備中，選擇萃取溶劑不僅要考慮到提取率的高低，還要考慮到食品安全性方面的問題，同時(shí)說明同一種提取方法不同提取條件，人參皂苷的提取率及組成具有較大差異。這與張艷榮等[26]研究基本一致，從而可知提取方法的不同與提取條件的不同都對(duì)人參皂苷的提取率及組成具有較大差異。

本研究?jī)H對(duì)微波輔助提取條件對(duì)人參皂苷含量的影響進(jìn)行研究，為更加細(xì)致的建立人參品質(zhì)評(píng)價(jià)系統(tǒng)及深度研究開發(fā)不同單體皂苷還需進(jìn)一步對(duì)不同提取方法及不同提取條件進(jìn)行比較分析。

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Determination of Contents of Total Saponins and Monomer Saponins in Panax ginseng by Microwave-Assisted Extractiion Method

GUO Shuangshuang, YANG Limin*, ZHANG Yiming, YANG Li, HAN Mei
(College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Single factor and orthogonal array designs were applied to optimize the conditions for microwave-assisted extraction of ginsenosides, and the determination of eight main monomer saponins and total saponins in Panax ginseng extracts was performed by high performance liquid chromatography and spectrophotometry to investigate the influence of different extraction conditions on the ginsenoside contents and composition in Panax ginseng extracts. The results showed that 1) the optimum extraction conditions for total saponins were determined as follows: microwave power, 600 W; extraction temperature, 45 ℃; extraction time, 5 min; the ratio of material to solvent, 1:20; and extraction number, 3; 2) the optimum extraction conditions for saponin monomers (leading to an extraction yield of 0.98%) were 300 W, 35 ℃, 15 min, a material-to-solvent of 1∶25, and three extraction cycles; 3) under the optimum conditions, with 80% aqueous methanol as the extraction solvent, the yield of total saponins was 6.02%, while the total yield of eight ginsenoside monomers was 0.43% compared to 0.71% with water-saturated butanol as the extraction solvent. In summary, ginseng quality evaluation and process optimization results were infl uenced by different extraction methods, extraction conditions and evaluation indexes.

composition analysis; quality evaluation; monomer saponin; orthogonal array design; high performance liquid chromatography (HPLC)

TS201.4

A

1002-6630（2015）02-0001-06

10.7506/spkx1002-6630-201502001

2014-06-11

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270371）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI03B01-02）；吉林省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（20125068）

郭雙雙（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幉馁|(zhì)量評(píng)價(jià)。E-mail：1530811226@qq.com

*通信作者：楊利民（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源生態(tài)與藥材質(zhì)量調(diào)控。E-mail：ylmh777@126.com