李 勇 （寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系 寧夏 銀川 750021） 張玉玲 （寧夏動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心 寧夏 銀川） 魏彥明 （甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅 蘭州）

試驗(yàn)研究

披針葉黃華堿對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響

李 勇 （寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系 寧夏 銀川 750021） 張玉玲 （寧夏動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心 寧夏 銀川） 魏彥明 （甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅 蘭州）

為研究披針葉黃華堿對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。取80只小鼠，按灌服劑量為6、13、25mg/kg，共分 3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)蒸餾水對(duì)照組(0.5ml/d)，連續(xù)給藥20d，觀察披針葉黃華堿對(duì)小鼠體重、臟器質(zhì)量、臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬能力及T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，灌服3個(gè)不同濃度披針葉黃華堿后小鼠體重、臟器質(zhì)量、臟器指數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬能力及T淋巴細(xì)胞數(shù)量均有所降低。在本試驗(yàn)條件下，中高濃度的披針葉黃華堿對(duì)小鼠的免疫功能有抑制作用。

披針葉黃華堿 小鼠 細(xì)胞免疫功能

1 材料與方法

1.1 材料 （1）設(shè)備儀器：ARll40/C型電子分析天平，奧毫斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；HWlA型電熱恒溫水溫箱，北京醫(yī)療設(shè)備廠；H-600型透射電子顯微鏡，日本日立產(chǎn)；冰箱、微量移液器、小鼠灌胃器、小動(dòng)物解剖器械等其他設(shè)備與器材，均由寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。（2）主要藥品與試劑：濃鹽酸、亞硝酸鈉、甲醛、(西安藍(lán)翔化工有限公司生產(chǎn))；甲基綠(上海化學(xué)試劑廠生產(chǎn))；副品紅(天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心生產(chǎn))；披針葉黃華堿由寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；醋酸-A萘酯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))；乙二醇單甲醚(上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法 （1）分組及給藥。20日齡ICR小鼠，體重18～22g，雌雄各半，共80只；體重2kg左右的公雞2只。以上試驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。試驗(yàn)前測(cè)得所用披針葉黃華堿的LD50=127.04 mg/kg，按照LD50的1/20、1/10、1/5設(shè)低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組給藥量分別為6、13、25mg/kg，并設(shè)飼喂蒸餾水為對(duì)照組(0.5ml/d)[4]。每天按以上劑量灌胃給藥，連續(xù)20d。飼喂期間各組給予充足的飼料和飲水。（2）披針葉黃華堿對(duì)小鼠體重和主要臟器指數(shù)的影響。小鼠末次灌胃2h后，稱(chēng)量體重，摘除眼球放血，頸椎脫臼處死，剪取實(shí)質(zhì)性臟器，分別稱(chēng)重，按以下公式計(jì)算各臟器指數(shù)：臟器指數(shù)(%)=(器官重量/體重)×100%。（3）披針葉黃華堿對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬機(jī)能的影響。每只小鼠腹腔注射10%淀粉肉湯0.5ml后輕揉腹部。5d后每只小鼠再腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸濁液0.5ml后輕揉腹腔。60min后，適量抽取小鼠腹腔液，并制成推片，在37℃恒溫箱內(nèi)干燥，用瑞氏染色液染色后，在油鏡下觀察計(jì)數(shù)每100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和每個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)，按照下列公式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)[5-7]。吞噬百分率(%)=(100個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞)×100%。吞噬指數(shù)=100個(gè)巨噬細(xì)胞中被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞。（4）披針葉黃華堿對(duì)小鼠血液中T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響。采用酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)染色法標(biāo)記小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù)[8]。摘除小鼠眼球后，取眶靜脈血液制成血涂片。將血涂片在4℃甲醛-丙酮緩沖固定液中固定10min，蒸餾水沖洗3次；放入孵育液中，37℃恒溫箱中孵育3h；用蒸餾水沖洗3次；放入2%甲基綠水溶液復(fù)染細(xì)胞核5min；用各級(jí)丙酮迅速脫水，二甲苯透明，最后用樹(shù)膠封片[9]。酯酶染色陽(yáng)性細(xì)胞即T淋巴細(xì)胞形態(tài)為圓形、胞質(zhì)少，胞核為綠色、圓形，胞質(zhì)邊緣及其他部位有1到多個(gè)粗大的紅色或棕紅色顆粒。酯酶染色陰性細(xì)胞(其他的淋巴細(xì)胞)形態(tài)也

如上述，但胞質(zhì)里無(wú)著色的顆粒[10]。顯微鏡觀察并記數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞中ANAE陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，按下式計(jì)算T淋巴細(xì)胞百分比：T淋巴細(xì)胞百分比=(ANAE陽(yáng)性細(xì)胞/100個(gè)淋巴細(xì)胞) ×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)用DPS3.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和Duncan新復(fù)極差法多重比較，數(shù)據(jù)用±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 披針葉黃華堿對(duì)小鼠質(zhì)量以及主要臟器指數(shù)的影響（1）由表1可知，灌服不同劑量的披針葉黃華堿20d后，各組小鼠的平均體重均有所下降，呈現(xiàn)出隨灌服劑量增加而下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比較，低劑量組小鼠體重下降不明顯(P>0.05)，而中劑量組和高劑量組小鼠體重明顯下降(P<0.05)。（2）表2、3可知，灌服不同劑量的披針葉黃華堿20d后，均可使小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺各主要臟器重量和臟器指數(shù)降低。中劑量組和高劑量組小鼠的器官重量比對(duì)照組明顯降低(P<0. 05)，中劑量組和高劑量組的臟器指數(shù)也比對(duì)照組明顯降低(P<0. 05)；隨著灌服劑量的增加，小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺各主要臟器重量及臟器指數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表1 不同濃度披針葉黃華堿對(duì)小鼠體重的影響 (g)

表2 不同濃度披針葉黃華堿對(duì)小鼠主要臟器重量的影響

表3 不同濃度披針葉黃華堿對(duì)小鼠主要臟器指數(shù)的影響

2.2 披針葉黃華堿對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬機(jī)能的影響表4可知，在低劑量組中，小鼠腹腔中的巨噬細(xì)胞的吞噬百分比明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，吞噬指數(shù)卻低于對(duì)照組(P<0.05)；在中劑量組和高劑量組中，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分比和吞噬指數(shù)都明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；隨著給藥劑量的增加，吞噬百分比和吞噬指數(shù)都呈降低趨勢(shì)。

表4 披針葉黃華堿對(duì)小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能的影響

2.3 披針葉黃華堿對(duì)小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響 表5可知，在高劑量組中，小鼠外周血液中的T淋巴細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組、低劑量組和中劑量組相比，明顯減少(P<0.05)，但對(duì)照組、低劑量組和中劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。

表5 披針葉黃華堿對(duì)小鼠血液中T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

3 討論

3.1 披針葉黃華堿對(duì)小鼠體重和主要臟器指數(shù)的影響通過(guò)灌服不同劑量的披針葉黃華堿20d后，每個(gè)試驗(yàn)小組中小鼠的平均體重都有下降，隨著生物堿濃度的增加，抑制體重的作用不斷增強(qiáng)。在同一試驗(yàn)條件下，小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺各內(nèi)臟器官的重量也有所下降，同時(shí)其臟器指數(shù)也降低，并且呈現(xiàn)出隨著灌服劑量的增加，小鼠各內(nèi)臟器官重量指數(shù)也下降的趨勢(shì)。脾臟和胸腺是主要的免疫器官，對(duì)機(jī)體的免疫力有著重要的影響。在以上試驗(yàn)條件下，披針葉黃華堿對(duì)小鼠脾臟和胸腺的發(fā)育有一定的抑制作用，則說(shuō)明此類(lèi)生物堿對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫力有抑制作用。

3.2 披針葉黃華堿對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬機(jī)能的影響

本試驗(yàn)中給小鼠灌服不同濃度的披針葉黃華堿后發(fā)現(xiàn)，除了低劑量組的小鼠外，中等劑量組和高劑量組小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞的吞噬機(jī)能隨灌服的生物堿濃度增加而降低(P<0.05)。而低劑量的生物堿能提高小鼠腹腔中巨噬細(xì)胞的吞噬百分比(P<0.05)，但其吞噬指數(shù)卻低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明此濃度的披針葉黃華堿能夠刺激更多的巨噬細(xì)胞參與吞噬過(guò)程，但同時(shí)卻抑制了單個(gè)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。分布于全身大多數(shù)器官組織的巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中的重要成員，其吞噬能力在一定程度上可以反映機(jī)體的免疫狀態(tài)[11-12]。從整體來(lái)看，披針葉黃華堿對(duì)小鼠腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬能力起到了一定的抑制作用。低濃度的披針葉黃華堿產(chǎn)生的藥理作用提示我們，隨著不斷降低披針葉黃華堿的濃度，其是否既能增加參與吞噬作用的巨噬細(xì)胞的數(shù)量，又能提高單個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬的能力，還有待于進(jìn)一步研究。

3.3 披針葉黃華堿對(duì)小鼠外周血液中T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響 本試驗(yàn)中，高劑量組中由于給小鼠灌服的披針葉黃華堿含量大，使得進(jìn)入小鼠體內(nèi)的生物堿對(duì)外周血液中的T淋巴細(xì)胞的數(shù)量有顯著的降低作用(P<0.05)，因而對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能起到抑制作用。低劑量組和中劑量組卻影響不大(P>0.05)。T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫。T淋巴細(xì)胞內(nèi)含有ANAE，而區(qū)別血液中T細(xì)胞和其他淋巴細(xì)胞的方法之一就是ANAE試驗(yàn)，是一種區(qū)分人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物成熟T細(xì)胞的測(cè)定方法[13-14]。通常情況下，動(dòng)物體內(nèi)脾臟和胸腺的增重意味著機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，淋巴細(xì)胞的增殖直接體現(xiàn)免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱。試驗(yàn)中一定濃度的披針葉黃華堿對(duì)小鼠脾臟和胸腺的增重有抑制作用，同時(shí)也能抑制其外周血液中T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。因此，可以推測(cè)由于披針葉黃華堿能夠抑制T淋巴細(xì)

胞的增殖分化和成熟，所以抑制了胸腺和脾臟的生長(zhǎng)，最終抑制了細(xì)胞免疫的功能。

綜上所述，在本試驗(yàn)的條件下，中高濃度的披針葉黃華堿對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫功能沒(méi)有促進(jìn)作用，反而有一定的抑制作用。

[1] 馬毓泉主編. 內(nèi)蒙古植物志[M]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社. 1985, 358-365.

[2] 周云風(fēng), 朱忠柯, 趙寶玉. 披針葉黃華的營(yíng)養(yǎng)成分及生物堿成分分析[J[. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2001, 415. 18.

[3] 文潤(rùn)玲, 戴壽芝, 裴秀英等. 老瓜頭總堿對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志, 1990, 12(2): 75-77.

[4] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則(2005)[M]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2006: 94-103.

[5] 鄭麗艷. 豬附紅細(xì)胞體病診斷方法的研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[6] 王月英. 新生大鼠免疫系統(tǒng)功能的建立與其影響因素的相關(guān)性研究[D]. 石家莊: 河北醫(yī)科大學(xué), 2004.

[7] 楊漢民. 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].2版.北京: 高等教育出版社, 1993: 166-167.

[8] 宋寧. 五種云南石拼多糖的提取、篩選及免疫調(diào)節(jié)作用的研究[D].昆明: 昆明醫(yī)學(xué)院, 2006.

[9] 袁伯倫, 于載樂(lè). 淋巴細(xì)胞酸性非特異性酯酶染色方法及其意義的初步探討[J]. 北京醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1982, 14(4): 345.

[10] 朱辛為. 血液酸性a-醋酸萘酯酶染色方法改進(jìn)[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1995, 17(3): 203.

[11] 王世若, 王興龍. 現(xiàn)代動(dòng)物免疫學(xué)[M].2版. 吉林: 吉林科學(xué)技術(shù)出版社, 2001: 530-531.

[12] 宋寧. 五種云南石拼多糖的提取、篩選及免疫調(diào)節(jié)作用的研究[D]. 昆明: 昆明醫(yī)學(xué)院, 2006.

[13] 楊漢春. 動(dòng)物免疫學(xué)[M].2版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2003: 370.

[14] JIN XW, HUANG S, WU X B. Immunohistochemical location of sixkinds ofendocrine cell from digestive tractofmisgurnus anguillicaudatus [J]. AgriculturalScience&Technology, 2009, 10(1):135-139.15832.

S853.75

A

1007-1733(2015)09-0001-03披針葉黃華(Thermopsisl anceolate)異名牧馬豆、土馬豆或野決明，屬豆科野決明屬植物，耐旱性強(qiáng)，廣泛分布于我國(guó)干旱和半干旱以及沙漠地區(qū)[1]。據(jù)資料記載本種為有毒植物，動(dòng)物采食其種子和全草可引起中毒，中毒嚴(yán)重的引起死亡，從而對(duì)畜牧業(yè)產(chǎn)生危害。該植物也是有名的藥用植物，具有興奮呼吸，抗輻射、祛痰止咳、抗癌等功效[2]。其所含的生物堿成分還具有一定的增強(qiáng)機(jī)體體液免疫力的作用[3]。但目前未見(jiàn)關(guān)于披針葉黃華堿對(duì)動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞免疫功能是否具有促進(jìn)作用的研究報(bào)道。本研究針對(duì)披針葉黃華堿是否對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生影響展開(kāi)研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用披針葉黃華資源提供相關(guān)試驗(yàn)依據(jù)。

2015–05–27）