劉杜菲(綜述)，王正中(審校)

(重慶市大渡口區(qū)人民醫(yī)院普外科，重慶 400084)

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樹突狀細(xì)胞在肝細(xì)胞癌免疫治療中的生物學(xué)特性及研究進(jìn)展

劉杜菲※(綜述)，王正中(審校)

(重慶市大渡口區(qū)人民醫(yī)院普外科，重慶 400084)

樹突狀細(xì)胞(DC)是人體內(nèi)一種專門承擔(dān)抗原呈遞功能的細(xì)胞，具備攝取并加工抗原的作用。高水平表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物分子、共刺激分子、黏附分子和分泌高水平的細(xì)胞因子，有效激發(fā)T細(xì)胞免疫。DC是目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。該文就DC的生物學(xué)特性、培養(yǎng)擴(kuò)增、作用機(jī)制和DC免疫治療原發(fā)性肝癌的新動態(tài)予以綜述。

肝細(xì)胞癌；樹突狀細(xì)胞；免疫治療

肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的90%，是我國最常見的惡性腫瘤之一；其起病隱匿、發(fā)展快，大多數(shù)患者就診時已是中晚期，且伴有不程度的肝硬化，手術(shù)切除率低，介入、放化療等方法遠(yuǎn)期療效不理想[1]。尋求一種合理有效的治療中晚期肝癌新策略具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用前景。伴隨分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)的研究進(jìn)展，以免疫治療為基石的生物療法受到越來越多的關(guān)注，并逐漸成為治療肝癌的重要手段。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，是天然免疫和適應(yīng)性免疫連接的一個重要紐帶，既能誘導(dǎo)初級免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)次級免疫反應(yīng)，是啟動、調(diào)節(jié)和保持免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。當(dāng)前，臨床上的肝細(xì)胞癌免疫療法發(fā)展迅速，并多以DC疫苗為基礎(chǔ)，現(xiàn)就DC免疫治療肝細(xì)胞癌的動態(tài)進(jìn)行綜述。

1 DC的生物學(xué)特性

DC是1973年美國科學(xué)家拉爾夫·斯坦曼在分析小鼠脾臟細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)的，與常見的巨噬細(xì)胞不一樣，這些細(xì)胞以表面存在一些類似樹根樣的“長突觸”而得名。DC是一種字義性命名，具備標(biāo)準(zhǔn)的樹杈樣形態(tài)，主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ、MHC-Ⅱ等類分子在膜表面呈高水平表達(dá)，能對淋巴器官及初始型T細(xì)胞產(chǎn)生刺激使其增殖活化，同時具有某些特異性抗原的細(xì)胞，均稱為DC，該細(xì)胞廣泛分布于脾臟、淋巴結(jié)、胸腺等淋巴器官以及皮膚、肝等非淋巴器官[3]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞共同的淋巴祖細(xì)胞及粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等的共同髓系祖細(xì)胞均能在體內(nèi)外分化為DC各類亞群；目前根據(jù)其來源和組織分布的不同，將DC分為5種亞群：漿細(xì)胞樣DC、經(jīng)典或組織局限性DC、遷移性DC、單核細(xì)胞來源DC和朗格漢斯細(xì)胞；當(dāng)抗原或病原體進(jìn)入機(jī)體，局部的DC可通過細(xì)胞表面的受體識別微生物糖原分子、核酸，感知病原體的入侵，起到免疫監(jiān)視作用[4]。

2 DC的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)

盡管DC在體內(nèi)廣泛分布于除腦及角膜中央部以外的組織器官中，然而其含量甚微，生理情況下半衰期為幾天到幾周，因此要通過直接提取的方法獲得足量的用于研究或治療的DC幾乎是不可能的，需建立成熟的DC體外培養(yǎng)技術(shù)。長期以來，研究者完善了多種培養(yǎng)擴(kuò)增DC的方法，均是應(yīng)用不同的細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中常用的是人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激生物因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、白細(xì)胞介素(interleukins，IL)10、IL-4、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)α、干擾素(interferon，IFN)γ、核因子κB寡核苷酸、脂多糖、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)β等；GM-CSF是最基本、最重要的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)DC前體細(xì)胞擴(kuò)增，促使其分化，并可在體外維持DC存活[5]。根據(jù)培養(yǎng)要求不同常在使用GM-CSF 的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他細(xì)胞因子進(jìn)行培養(yǎng)，如脂多糖、TNF-α、IFN-γ是常用的促DC成熟的細(xì)胞因子，而IL-4、IL-10、 TGF-β和核因子κB寡核苷酸則能抑制中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，維持DC處于未成熟狀態(tài)[6-7]。當(dāng)用骨髓或臍血CD34+細(xì)胞作為前體時，則用TNF-α代替IL-4，因為TNF-α可降低粒細(xì)胞產(chǎn)生，上調(diào)細(xì)胞GM-CSF-β鏈的表達(dá)，增強(qiáng)其對細(xì)胞因子信號的反應(yīng)能力[8]。目前，較為常用的方法是收集外周血單個核細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，去除非貼壁細(xì)胞，加入GM-CSF 1000 U/mL和IL-4 500 U/mL,刺激細(xì)胞向DC細(xì)胞分化[9]。根據(jù)生長情況，2～3 d進(jìn)行一次半量換液，在第5日加入腫瘤抗原裂解物(50 mg/L)，刺激抗原特異性的DC產(chǎn)生；第6日加IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子，刺激DC成熟；第7日檢測細(xì)胞活力，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表型CD11c、HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD83、CD86等的表達(dá)，成熟的DC高表達(dá)這些表面標(biāo)記[10]。

3 DC的作用機(jī)制

DC是人體內(nèi)一種專門承擔(dān)抗原呈遞功能的細(xì)胞，其主要是捕獲、處理及呈遞抗原，進(jìn)而觸發(fā)適度的免疫應(yīng)答反應(yīng)。不成熟的DC呈現(xiàn)C3b受體、免疫球蛋白Fc段受體、甘露糖受體及其他Toll樣受體的高表達(dá)，低表達(dá)MHCⅠ/Ⅱ類分子，其捕獲、處理抗原的作用較強(qiáng)，而呈遞抗原并觸發(fā)免疫應(yīng)答的作用小[11]。成熟的DC則對MHCⅠ/Ⅱ類分子、CD40、CD80/86及CD1a、CD83分子產(chǎn)生高表達(dá)，其捕獲、處理抗原的作用較弱，而呈遞抗原并觸發(fā)免疫應(yīng)答的作用強(qiáng)，是人體抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要啟動者和參與者[12]。DC具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，可通過分泌不同類型的細(xì)胞因子影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答的類型，并參與T細(xì)胞免疫耐受的形成；DC和T細(xì)胞相結(jié)合可產(chǎn)生大量IL-12、IL-18，刺激T細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞生成，刺激Th1型免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的清除；此外，還可通過觸發(fā)穿孔素P顆粒酶B及FasL/Fas作用的途徑加強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞毒效應(yīng)[13]。而DC分泌趨化因子則主要趨化初始型T細(xì)胞并誘導(dǎo)T細(xì)胞的聚集，使T細(xì)胞的保持效應(yīng)在腫瘤生長部位長期作用，并可通過釋放IL-12、IFN-γ等抗血管形成產(chǎn)物而抑制腫瘤血管的生成；同時趨化因子則以正反饋旁分泌的形式進(jìn)一步活化DC，增加CD80、CD86與IL-12的表達(dá)，而DC也通過向CD8+T細(xì)胞提呈抗原肽促使CD8+T細(xì)胞的活化，CD4+與CD8+T細(xì)胞可同時進(jìn)一步以直接殺傷和分泌細(xì)胞因子的方式，加強(qiáng)人體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫應(yīng)答[14]。

4 DC免疫治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌

肝癌組織及外周DC的數(shù)量減少和功能缺陷均可導(dǎo)致DC不能有效遞呈抗原、激活T淋巴細(xì)胞、誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)，致使腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移[15]。肝癌的免疫治療需促進(jìn)抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞消滅腫瘤細(xì)胞，同時抑制抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，以DC為基礎(chǔ)的免疫策略具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。

4.1 DC免疫治療肝癌的基礎(chǔ)研究 將肝癌細(xì)胞或組織的相關(guān)組分進(jìn)行提取，或?qū)δ[瘤抗原進(jìn)行提純，再把提取物和DC一同培育，此時有效抗原可被DC捕獲并遞呈，以這種完成致敏的DC疫苗用于接種，可產(chǎn)生特異性較高的免疫反應(yīng)。Tatsumi等[16]將致敏DC直接對CMS4肝癌荷瘤小鼠進(jìn)行肝臟注射，觀察到荷瘤小鼠腫瘤徹底消失，并使生存期明顯延長。Chen等[17]通過BCGHSP70活化DC以提高DC的抗原遞呈功能，從而利于DC將所攜帶的抗原有效地遞呈給T細(xì)胞。王建等[18]發(fā)現(xiàn)，DC-Walker-256融合的腫瘤疫苗在大鼠肝癌模型中能誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞建立有效的抗腫瘤免疫，同時下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素2的水平，抑制腫瘤血管新生，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。杜文貞和于天霞[19]在用甲胎蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV-AFP)轉(zhuǎn)導(dǎo)人DC體外誘導(dǎo)抗肝癌免疫應(yīng)答中發(fā)現(xiàn)，AAV-AFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC高表達(dá)人類MHC-Ⅰ類分子(HLAⅠ,97.12%)、HLAⅡ(97.32%)、CD80(38.94%)、CD83(60.84%)、CD86(98.14%)等DC的典型表面標(biāo)記；AAV-AFP轉(zhuǎn)導(dǎo)后，81.2%的DC表達(dá)甲胎蛋白,AAV-AFP+DC能有效地刺激自體T細(xì)胞增殖、活化；激活后19.84%的CD4+T細(xì)胞和18.65%的CD8+T細(xì)胞能分泌IFN-γ而不分泌IL-4,對甲胎蛋白陽性的肝癌細(xì)胞系HepG2、BEL7402殺傷率分別為56.45%和78.94%；因此認(rèn)為，AAV-AFP+DC體外能誘導(dǎo)出有效的抗甲胎蛋白陽性肝癌免疫應(yīng)答。

4.2 DC免疫治療肝細(xì)胞癌的臨床效果 Shimoda等[20]用DC負(fù)載的天冬氨酸-β-羥化酶瘤苗免疫療法能抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生，亦能減緩移植瘤生長；從健康人及肝癌患者提取的外周血單個核細(xì)胞制備的DC-天冬氨酸-β-羥化酶肝癌疫苗能強(qiáng)烈刺激抗原特異性的CD4+T細(xì)胞免疫，減少肝細(xì)胞肝癌復(fù)發(fā)。Nakamoto和Kaneko[21]也發(fā)現(xiàn)，以DC為基礎(chǔ)的免疫靶向治療能降低肝癌復(fù)發(fā)率。Bray等[22]發(fā)現(xiàn)，給肝癌患者注射肽負(fù)載的DC疫苗能增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性，降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞出現(xiàn)的頻率。Palmer等[23]用HepG2肝癌細(xì)胞系致敏肝癌患者DC,對35例晚期肝癌患者進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗，取得了較好的臨床效果，疾病控制率達(dá)28%，約50%患者甲胎蛋白水平下降，其中4例患者甲胎蛋白水平下降達(dá)70%。肝癌細(xì)胞相關(guān)組分致敏的DC疫苗可于肝癌患者體內(nèi)激發(fā)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，在患者體內(nèi)建立腫瘤特異性的、持久的免疫應(yīng)答，取得了一定的臨床效果，且無明顯的不良反應(yīng)[24]。Nakamoto等[25]對13例肝動脈栓塞治療后的肝癌患者注射鏈球菌源性抗腫瘤免疫治療劑OK432刺激后的DC疫苗，結(jié)果顯示，其無復(fù)發(fā)且存活率較對照組高。

5 小 結(jié)

DC是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞,其能高效攝取、加工處理和遞呈抗原，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。以DC為基礎(chǔ)的肝癌免疫治療是當(dāng)前的研究熱點，已經(jīng)在肝癌患者中顯示出較強(qiáng)的抗肝癌免疫活性和初步臨床療效，對于改善肝癌患者生活質(zhì)量、降低復(fù)發(fā)率有著非常重要的意義。但DC的制備、臨床應(yīng)用都欠缺規(guī)范化管理，而且DC與肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的確切機(jī)制尚不清楚。相信隨著肝癌免疫治療基礎(chǔ)研究的不斷深入和分子免疫學(xué)、生物學(xué)的發(fā)展，肝癌的DC免疫治療將會更加合理，更有前景。參考文獻(xiàn)

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Biological Characteristics and Research Progress of Dendritic Cells in Immunotherapy for Hepatocellular Carcinoma

LIUDu-fei，WANGZheng-zhong.

(DepartmentofGeneralSurgery,ChongqingDadukouDistrictPeople′sHospital,Chongqing400084，China)

Dendritic cell(DC) is a kind of antigen-presenting cells in human body.It uptakes and delivers antigen.High-level expression of major histocompatibility complex molecules,costimulatory molecules,adhesion molecules and high-level secretion of cytokines can stimulate T cell immunity.DC has been known as the most powerful antigen-presenting cell in human body,it plays an important role in the incidence and development of liver diseases.Here is to make a review of the latest research progress on DC,include the biological characteristics,culturing,mechanism of action,and the DC immunotherapy for hepatocellular carcinoma.

Hepatocellular carcinoma； Dendritic cell； Immunotherapy

R392.1

A

1006-2084(2015)12-2177-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.024

2014-07-10

2014-10-13 編輯：鄭雪