馬軍++魏明婉++王耀嶸++李麒麟++陳燕

摘 要 從三亞紅樹林保護(hù)區(qū)中篩選出一株產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌，通過(guò)改變培養(yǎng)溫度、初始pH值和鹽濃度等因素研究該菌株的最適產(chǎn)酶條件，同時(shí)也分析了該菌株所產(chǎn)粗酶的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明：該菌株屬于中溫產(chǎn)酶菌，產(chǎn)淀粉酶的最適溫度為40℃，最適pH值為8，鹽耐受能力可達(dá)到4%。酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，該菌株產(chǎn)生的淀粉酶在40℃保溫150 min后仍有70%以上的相對(duì)酶活力，在pH為9的環(huán)境中孵育1 h，相對(duì)酶活力可達(dá)到90%以上。這些結(jié)果表明，該產(chǎn)淀粉酶菌株對(duì)熱帶地區(qū)海水環(huán)境具有較好的適應(yīng)性，其作為消化酶類飼料添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 紅樹林 ；枯草芽孢桿菌 ；酶學(xué)性質(zhì) ；淀粉酶

分類號(hào) TQ925

Amylase-producing Conditions and Enzymatic Properties of

Bacillus subtilis from Mangrove Rhizosphere Soil

MA Jun WEI Mingwan WANG Yaorong LI Qilin CHEN Yan

（College of Tropical Biology and Agronomy， Qiongzhou University， Sanya， Hainan 572022）

Abstract A Bacillus subtilis strain which could produce amylase was isolated from mangrove rhizosphere soil in Sanya. The effects of culture conditions on the enzyme producing ability of strain were studied with different culture temperature， initial pH and salt concentration. In addition， The properties of amylase excreted by this strain were analyzed by the thermal stability and pH stability. The results showed that the strain was belonged to the mesophilic enzyme producing bacteria， the amylase-producing optimum temperature was 40℃， the optimal pH value was 8， and the salt tolerance ability could reach 4%. The study on enzymatic properties showed that the amylase produced by this strain was still 70% relative enzyme activity after 150 min at 40℃， and the relative enzyme activity of the amylase could reach more than 90% after 1h in the pH=9 environment. It suggested that the amylase producing strain had better adaptability for tropical marine environment， and had broad application prospects as a digestive enzyme feed additive.

Keywords mangrove ； Bacillus subtilis ； enzymatic properties ； amylase

紅樹林位于熱帶、亞熱帶陸海交匯的潮間帶，由于其獨(dú)特的地理環(huán)境，常年遭受海水周期性浸淹、河口有機(jī)質(zhì)沉積及落葉腐敗作用等影響，紅樹林形成了獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)。在紅樹林內(nèi)，植物凋落與動(dòng)物殘?bào)w非常豐富，這為孕育特殊的微生物提供了特殊的營(yíng)養(yǎng)與生境，同時(shí)也為分離可分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等酶類的微生物類群提供了必要的資源基礎(chǔ)[1-2]。

淀粉酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多、特點(diǎn)各異，可應(yīng)用于釀酒、食品、醫(yī)藥、紡織、飼料等多種領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景及市場(chǎng)開發(fā)潛力。由于枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的環(huán)境抗逆性，其不但能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等[3]，還能夠提高動(dòng)物免疫力[4]，促進(jìn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)消化吸收[5]，拮抗多種病原體[6]，是中國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的可直接用于飼喂動(dòng)物且允許使用的益生菌菌種之一。因此，篩選產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌，并將其作為飼料添加劑分解飼料中含淀粉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，幫助養(yǎng)殖動(dòng)物充分吸收和利用飼料營(yíng)養(yǎng)，已成為飼料行業(yè)的一個(gè)新突破點(diǎn)。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的不斷提高，高效利用飼料營(yíng)養(yǎng)，減少殘存飼料堆積和排放，已經(jīng)成為改善養(yǎng)殖水質(zhì)惡化的新途徑?？莶菅挎邨U菌能通過(guò)產(chǎn)生大量的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等胞外酶來(lái)分解轉(zhuǎn)化飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而產(chǎn)生小分子有機(jī)酸、氨基酸、糖類等物質(zhì)，促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)吸收和利用，這為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供了新的動(dòng)力。本研究對(duì)從紅樹林根際土壤中分離出的一株產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌進(jìn)行淀粉酶學(xué)性質(zhì)分析，以期為該株菌的進(jìn)一步研究及其在海水養(yǎng)殖飼料添加劑中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株由本實(shí)驗(yàn)室從三亞市白鷺公園紅樹林保護(hù)區(qū)根際土壤中分離得到，編號(hào)為JCHL0207（KP834902）。endprint

淀粉培養(yǎng)基（固體）：可溶性淀粉1%+蛋白胨1%+葡萄糖0.5%+NaCl 0.5%+牛肉膏0.5%，瓊脂粉0.8%，用去離子水配制，pH 7.0，于121℃中蒸汽滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%+蛋白胨1%+氯化鈉0.5%，用去離子水配制，pH 7.0～7.4，于121℃下蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉1%+麩皮1%+酵母粉1%+氯化鈉0.5%+磷酸二氫鉀0.2%+磷酸氫二鈉0.2%，用去離子水配制，pH 7.0，于121℃下蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備

將菌株接種到種子培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)18～24 h；以1%的接種量接種到基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，于130 r/min、30 ℃搖床中培養(yǎng)48 h。菌液以5 000 g的離心力離心2 min，上清液即為待測(cè)粗酶液。

1.2.2 淀粉酶水解圈測(cè)定

用滴種法將菌液接種于淀粉培養(yǎng)基上并培養(yǎng)48 h，采用碘液染色，在菌落周圍若有透明圈產(chǎn)生則證明芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶。用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑，根據(jù)兩者比值大小初步確定淀粉素酶活性的高低。

1.2.3 酶活力測(cè)定

淀粉酶活力測(cè)定參考DNS法[7-9]。取1 mL粗酶液，加1 mL 2%的可溶性淀粉及3 mL去離子水，于60℃水浴中預(yù)熱5 min，加入1 mL濃度為0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH=6.0），于60 ℃水浴中保溫30 min；加入3，5-二硝基水楊酸1.5 mL，置于沸水中5 min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至20 mL，空白對(duì)照采用加酸鈍化的粗酶液，用分光光度計(jì)分別測(cè)定OD520nm值。

酶活力根據(jù)下式計(jì)算：

酶活力=（N×A）/（K×t×V）

A為520 nm處的吸光度；K為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；t為反應(yīng)時(shí)間；V為參與反應(yīng)的酶液體積；N為酶液的稀釋倍數(shù)。

酶活定義：在60℃，pH為6.0的條件下，單位體積粗酶液30 min內(nèi)將淀粉轉(zhuǎn)化成1 mg麥芽糖所需的酶量為一個(gè)單位酶活，用MMU表示。

1.2.4 培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響試驗(yàn)

（1）溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。以1%的接種量將該菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于20、30、40、50、60℃下培養(yǎng)48 h后，以500×g離心10 min，收集上清粗酶液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

（2）初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。以1%的接種量將該菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5、6、7、8、9、10和11，于30℃培養(yǎng)48 h后，以500×g離心10 min，收集上清粗酶液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

（3）鹽濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。以1%的接種量將該菌株接種于含不同濃度氯化鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，氯化鈉濃度分別為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%，培養(yǎng)基初始pH為7，于30℃培養(yǎng)48 h后，以500×g離心10 min，收集上清粗酶液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.2.5 酶穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測(cè)定

酶穩(wěn)定性測(cè)定。以1%的接種量將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)48 h后，以500×g離心10 min，收集上清粗酶液，將粗酶液分別孵育于40、60、80℃的水浴鍋中，保溫不同時(shí)間后，直接測(cè)定殘余酶的活力，將不經(jīng)保溫的酶活設(shè)為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

pH穩(wěn)定性測(cè)定。以1%的接種量將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)48 h后，以500×g離心10 min，收集上清粗酶液，用稀鹽酸或氫氧化鈉將粗酶液的pH值分別調(diào)至5、6、7、8、9、10，在室溫下放置1 h后，測(cè)定殘余酶的活力，以離心后收集的上清粗酶液的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶水解圈測(cè)定

采用碘液染色法對(duì)菌落及其周圍進(jìn)行染色。如圖1所示，菌落周圍都出現(xiàn)了明顯的水解圈，分別對(duì)水解圈直徑及菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，重復(fù)3次，通過(guò)水解圈直徑與菌落直徑的比值，得出該菌株淀粉酶水解能力為（4.69±0.02）。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的分析

2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

培養(yǎng)溫度是影響菌株產(chǎn)酶能力最重要的因素之一。由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為20～40℃時(shí)，菌株產(chǎn)生的淀粉酶活力隨溫度升高而上升，在40℃時(shí)，淀粉酶活力最高，之后隨溫度升高而快速降低。因此該菌株產(chǎn)淀粉酶的最適培養(yǎng)溫度為40℃，且在20～40℃都有較高的產(chǎn)酶能力，培養(yǎng)溫度高于40℃時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力受到較強(qiáng)的抑制作用。

2.2.2 初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)菌株的產(chǎn)酶能力具有一定程度的影響。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH在5～9時(shí)，菌株產(chǎn)生的淀粉酶活性都維持在30 MMU以上，其中pH為8時(shí)，所產(chǎn)生的酶活力達(dá)到40 MMU以上；當(dāng)pH大于9時(shí)，酶活力明顯降低至10 MMU以下。說(shuō)明該菌株對(duì)pH值有一定的耐受范圍，但較強(qiáng)的堿性環(huán)境不利于菌株產(chǎn)淀粉酶。

2.2.3 鹽濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

鹽耐受能力直接影響到產(chǎn)酶芽孢桿菌產(chǎn)酶的穩(wěn)定性，尤其是對(duì)于海水養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)，菌株在鹽濃度達(dá)到3.0%～3.5%時(shí)，仍然具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力是將其應(yīng)用于水產(chǎn)飼料添加劑的前提。從圖4可知，鹽濃度在0至4%的范圍內(nèi)，菌株所產(chǎn)的淀粉酶活力基本維持在40 MMU左右，下降平緩，有一定的耐受性；當(dāng)鹽濃度超過(guò)4%時(shí)，菌株所產(chǎn)的淀粉酶活力隨著鹽濃度的升高而快速下降；當(dāng)鹽濃度達(dá)到10%時(shí)，其所產(chǎn)淀粉酶的酶活力降低至10 MMU左右，但仍然具有一定程度的淀粉轉(zhuǎn)化能力。endprint

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 酶的熱穩(wěn)定性分析

將粗酶液分別在40、60、80℃水浴鍋中保溫不同時(shí)間，以不經(jīng)保溫的酶活為100%，在60℃測(cè)定殘余酶活。從圖5可以看出，該淀粉酶在40℃時(shí)，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力變化幅度較小，保溫150 min時(shí)仍有70%以上的相對(duì)酶活力，說(shuō)明該酶在40℃環(huán)境下具有較高的熱穩(wěn)定性；在60、80℃分別保溫150 h，酶活力下降迅速，殘留酶活分別降低至13.7%和9.3%。說(shuō)明該酶不適于高溫下應(yīng)用。

2.3.2 酶的pH值穩(wěn)定性分析

由圖6可知，該淀粉酶具有較廣的pH耐受范圍，在pH為5的環(huán)境下保存1 h后，相對(duì)酶活性仍然維持在60%以上；隨著pH值的上升，相對(duì)酶活性也隨之上升，在pH為9時(shí)，相對(duì)酶活性最高，達(dá)到90%以上；而當(dāng)pH值大于9時(shí)，酶極容易失活，相對(duì)酶活性快速下降至30%左右。說(shuō)明該淀粉酶主要耐受pH范圍為5～9，不耐受pH值大于9的強(qiáng)堿性環(huán)境。

3 討論

紅樹林介于陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)之間，由于常年受到周期性海水浸淹，紅樹林土壤高度鹽責(zé)化、缺氧和高輻射的特性形成了獨(dú)特而又豐富的微生物類群[10-11]。研究結(jié)果表明，細(xì)菌是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中最主要的類群，其中芽孢桿菌屬分布比例較高，而真菌和放線菌在紅樹林土壤中分布相對(duì)較少[12]。目前，關(guān)于從紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中獲取的產(chǎn)淀粉酶微生物的研究主要集中于真菌和放線菌上[13-14]，而關(guān)于產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的研究還未見報(bào)道。

枯草芽孢桿菌是當(dāng)今酶生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的菌種之一，由于其具有產(chǎn)酶量高、種類多、安全性高等特點(diǎn)，在現(xiàn)代酶制劑生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。大量研究表明，枯草芽孢桿菌能分泌植酸酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶等十幾種酶類[3]，這些活性酶能降解飼料中的淀粉、多糖和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高飼料的消化利用率，從而促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)性能[5]。目前，適用于海水養(yǎng)殖飼料添加劑的產(chǎn)酶菌株還相對(duì)少見，常見的都是從陸源土壤、養(yǎng)殖水、魚體腸道等環(huán)境中分離的產(chǎn)酶微生物，這些菌株在偏堿性、鹽度高的環(huán)境中產(chǎn)酶較不穩(wěn)定，無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)的需求。

本研究中所使用的菌株是從紅樹林根際土壤中篩選到的枯草芽孢桿菌（編號(hào)為JCHL0207），該菌株在pH為5～9的范圍內(nèi)，具有較為穩(wěn)定的產(chǎn)酶能力，并且其產(chǎn)生的淀粉酶在該pH范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的酶活性，說(shuō)明該菌株具有較好的pH耐受范圍，可適用于偏堿性的天然海水環(huán)境（pH值為7.9至8.4）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，該菌株在培養(yǎng)溫度為20～40℃時(shí)，產(chǎn)酶能力隨溫度升高而增強(qiáng)，其最適產(chǎn)酶溫度為40℃，并且該菌株所產(chǎn)生的淀粉酶在40℃的環(huán)境中也有較強(qiáng)的酶穩(wěn)定性，保溫150 min時(shí)，酶活性僅降低了30%左右。值得一提的是，該菌株具有較強(qiáng)的鹽耐受能力，其在氯化鈉濃度為0～4%的環(huán)境中仍然具有較為穩(wěn)定的產(chǎn)酶能力，說(shuō)明該菌株可適應(yīng)熱帶地區(qū)海水養(yǎng)殖環(huán)境，其作為消化酶類飼料添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉 穎，洪 葵，莊 令，等. 紅樹林樣品不經(jīng)分離的微生物群體培養(yǎng)物生物活性研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47（1）：110-114.

[2] 龍 寒，向 偉，莊鐵城，等. 紅樹林區(qū)微生物資源[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2005，24（6）：696-702.

[3] 楊 峰，章亭洲. 枯草芽孢桿菌生物學(xué)特性的研究[J]. 飼料研究，2011，34（3）：34-36.

[4] 沈文英，李衛(wèi)芬，梁 權(quán)，等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23（5）：881-886.

[5] 王學(xué)東，咼于明，姚 娟，等. 芽孢桿菌在仔豬日糧中的應(yīng)用效果初探[J]. 中國(guó)畜牧雜志，2008，44（21）：46-48.

[6] 陳天游，董思國(guó)，田萬(wàn)紅，等. 枯草芽孢桿菌活菌體外拮抗6種腸道致病菌的研究[J]. 微生物學(xué)雜志，2004，24（5）：74-76.

[7] 趙 凱，許鵬舉，谷廣燁. 3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含景的研究[J]. 食品科學(xué)，2008，29（8）：534-536.

[8] 唐麗江，王振華，王 迪. 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌高產(chǎn)菌株的篩選[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（12）：5 362-5 363，

5 371.

[9] 張應(yīng)玖，朱學(xué)軍，關(guān) 鍵，等. 一種新型淀粉酶的鑒定及其產(chǎn)酶菌株的篩選[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2002，29（5）：38-41.

[10] 莊鐵誠(chéng)，林 鵬. 紅樹林凋落葉自然分解過(guò)程中土壤微生物的數(shù)量動(dòng)態(tài)[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1993，32（3）：365-370.

[11] 張瑜斌，莊鐵誠(chéng)，楊志偉，等. 海南東寨港紅樹林土壤微生物初探[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2001，20（1）：63-64.

[12] 林 鵬，張瑜斌. 九龍江口紅樹林土壤微生物的類群及抗菌活性[J]. 海洋學(xué)報(bào)（中文版），2005，27（3）：133-141.

[13] 周茂洪，趙肖為，周 林，等. 產(chǎn)淀粉酶的海洋曲霉菌的分離及酶學(xué)特性初步研究[J]. 海洋學(xué)研究，2007，25（3）：59-65.

[14] 何 潔，張道鋒，徐 盈，等. 印度洋紅樹林沉積物可培養(yǎng)海洋放線菌多樣性及其活性[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2012，52（10）：1 195-1 202.endprint