張宇宏，鄭基煥，毛潤乾*，龐 虹

(1.廣東省昆蟲研究所，廣東省農(nóng)業(yè)害蟲綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260;2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275)

細(xì)胞色素P450 蛋白是細(xì)胞色素P450 單加氧酶系的末端氧化酶，屬于CYP 基因家族，決定著P450 酶系催化底物的廣泛性和專一性(Backes，1993;Namiki，2005)。細(xì)胞色素P450 不僅對多種外源化合物和內(nèi)源化合物的氧化代謝起作用，還參與一些起重要生理功能的內(nèi)源性物質(zhì)如激素、脂肪酸的代謝，在生物體中起十分重要的作用。在昆蟲體內(nèi)，細(xì)胞色素P450 參與各類外源性物質(zhì)(藥物、植物次生物質(zhì)、植物毒素)和內(nèi)源性物質(zhì)(保幼激素及其類似物、蛻皮激素、脂肪酸和信息素)的合成代謝(Maibèche-Coisne et al.，2002;Helvig et al.，2004)，其中對殺蟲劑的代謝是昆蟲產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制(陳秋霞和黃炯烈，2001;邱星輝等，2003)。因其生物學(xué)的重要性，一直是生物學(xué)研究的一個重要對象(邱星輝和冷欣夫，1998;Wong，1998)。

孟氏隱唇瓢蟲Cryptolaemus montrouzieri Mulsant屬鞘翅目Coleoptera 瓢甲科Coccinellidae，原產(chǎn)于澳大利亞，1888-1891年間首次由Albert Koeble 引進(jìn)美國加利福尼亞州用于防治柑橘上的粉蚧(李麗英，1993)，由于其作為捕食性天敵的優(yōu)良特性，被廣泛引種到世界各地進(jìn)行害蟲防治(湯才等，1995;Attia ＆ El-Arnaouty，2007;Mani ＆Krishnamoorthy，2008)。據(jù)報道，孟氏隱唇瓢蟲可以捕食20 多種介殼蟲(蔣瑞鑫等，2009)，在世界范圍內(nèi)的分布，主要包括我國的廣東、福建、臺灣，以及印度尼西亞、菲律賓、俄羅斯、法國、意大利、新西蘭、非洲、美國、西印度群島、密克羅尼西亞、澳大利亞、泰國、印度、肯尼亞、西班牙、埃及等亞熱帶和熱帶地區(qū)(曾濤和龐虹，2000)。目前國內(nèi)外對昆蟲抗藥性的研究主要集中在一些著名的模式生物或世界范圍發(fā)生的害蟲上，對天敵尤其是瓢蟲的抗藥性發(fā)生機(jī)理的研究并不多見(Zhang et al.，2012)，本研究對孟氏隱唇瓢蟲P450 家族的基因進(jìn)行克隆并分析，為瓢蟲抗藥性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 孟氏隱唇瓢蟲的飼養(yǎng)與材料收集

孟氏隱唇瓢蟲由中山大學(xué)昆蟲園在25℃±1℃，14L∶10D 條件下飼養(yǎng)。大腸桿菌DH5α 菌株由廣東省昆蟲研究所保存。液氮處理孟氏隱唇瓢蟲成蟲，快速置于冰浴的EP 管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒購自上海生工公司，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)購自寶生物(大連)公司，TaqDNA 聚合酶、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和pGM-T 載體購自天根生化科技(北京)有限公司，PCR 引物由華大科技(深圳)公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物序列及作用

表1 CYP 9Z401 基因的cDNA 擴(kuò)增的策略和引物Table 1 Cloning strategy and primers for CYP9Z401 cDNA

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 的抽提、cDNA 合成和PCR 反應(yīng)

按UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒提供的方法提取孟氏隱唇瓢蟲的總RNA。取昆蟲樣品，每15-25 mg 組織加入0.5 mL Trizol，用勻漿器勻漿處理。將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5-10 min，加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩30 s，室溫放置3 min。12000 rpm 4℃離心10 min。吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入1/2 倍體積無水乙醇，混勻。將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置2 min，12000 rpm 離心3 min，倒掉廢液。將吸附柱放回收集管中，加入500 μL RPE Solution，靜置2 min，10000 rpm 離心30 s，倒掉廢液。重復(fù)上一步。將吸附柱放回收集管中，10000 rpm 離心2 min。將吸附柱放入干凈1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入30 μL DEPC-H2O，靜置5 min，12000 rpm 離心2 min，-70℃保存RNA 溶液。

先采用紫外分光光度計(jì)測定總RNA 溶液的濃度，再按cDNA 第一鏈合成試劑盒的方法合成cDNA 第一鏈。在總體積為25 μL 的EP 管中依次加入1 μg 總RNA，5 μL 的5×buffer，2 μL 的dNTP(10 mM)，1 μL 的AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，補(bǔ)充DEPC 處理水到25 μL，在42℃的水浴中保溫1 h 后，再放入70℃的水浴10 min 滅活A(yù)MV 反轉(zhuǎn)錄酶，即獲得一鏈 cDNA。引物:P450-DF 和 P450-DR(表1)根據(jù)已知的昆蟲P450 基因的保守結(jié)構(gòu)域和本實(shí)驗(yàn)室保存的孟氏隱唇瓢蟲EST 序列比對后設(shè)計(jì)。反應(yīng)體系:25 μL 反應(yīng)體系中含2.5 μL 10×PCR buffer，0.01 μmol/each dNTP，10 pmol/each primer，1.5 units Taq-Polymerase，約2 ng cDNA。按下述條件進(jìn)行PCR:樣品先94℃預(yù)變性3 min，94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30 個循環(huán)后72℃ 10 min，擴(kuò)增完畢后4℃終止反應(yīng)。

1.2.2 PCR 產(chǎn)物的克隆與測序

將PCR 產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶后，連接到Tiangen 的pGM-T 載體中，然后將其轉(zhuǎn)入DH5α 細(xì)胞中，挑取單個白斑驗(yàn)證后送往深圳華大科技公司測序。

1.2.3 cDNA 的末端快速擴(kuò)增(RACE)

根 據(jù) Clontech 的 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 分別構(gòu)建孟氏隱唇瓢蟲的3'和5'RACE 文庫。P450-3A，P450-3B，P450-5A，P450-5B 和P450-5C 引物根據(jù)獲得中間片段序列來設(shè)計(jì)(表1)，分別用于擴(kuò)增孟氏隱唇瓢蟲P450 基因的3'和5 '端序列。3'RACE 擴(kuò)增采用試劑盒中的UPM 引物和P450-3A，二次巢式PCR時采用NUP 和P450-3B。同樣5'RACE 擴(kuò)增采用試劑盒中的UPM 引物和P450-5A，二次巢式PCR時采用NUP 和P450-5B。采用一樣的PCR 程序:94℃10 min 后，30 個循環(huán)的94℃30 s，48℃30 s和72℃120 s。P450-3B 和P450-5C 分別用于驗(yàn)證3'和5'RACE 的菌落PCR。

1.2.4 序列分析及系統(tǒng)學(xué)分析

序列分析和基因特性分析采用 Dnastar、Dnaman、Vector 等軟件和TMHMM Server v.2.0:http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/SignalP 3.0 Server:http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/和Multiple sequence alignment by Florence Corpet:http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html 等在線分析軟件進(jìn)行。序列比對、氨基酸同源性分析及系統(tǒng)樹構(gòu)建等采用Blast、ClustalX 和MEGA5.2 等分析。蛋白結(jié)構(gòu)同源建模通過SWISS-MODEL:http://swissmodel.expasy.org 在線工具獲得，用 PSIPRED:http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/預(yù)測蛋白二維結(jié)構(gòu)，用 SWISS-PDBViewer 軟件觀察蛋白三維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 孟氏隱唇瓢蟲的P450 基因的克隆和序列分析

孟氏隱唇瓢蟲的P450 基因的克隆中，首先經(jīng)過兩次PCR，利用P450-DF 和P450-DR 作為引物，獲得了一段約1500 bp 左右的片段。測序結(jié)果顯示為P450 基因，根據(jù)這段序列，分別在3'和5'端設(shè)計(jì)了特異性引物，具體見圖1。利用孟氏隱唇瓢蟲的3'和5'RACE 文庫作為模板經(jīng)過兩輪的PCR擴(kuò)增后，各顯示出300 bp 左右的條帶?；厥?、連接、轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證和測序的結(jié)果表明為所需要的P450 基因序列。

拼接3'和5'RACE 的序列和中間片段，獲得的孟氏隱唇瓢蟲的 P450 基因全長，命名為CYP9Z401。該基因的cDNA 全長為1722 bp，編碼528 個氨基酸，并預(yù)測出分子量為61.27，等電點(diǎn)為6.58。翻譯的起始密碼子為50 位的ATG，終止密碼子TGA 位于1634-1636 位，其后有終止信號AATAAA (圖1)。采用TMHMM Server v.2.0 和SignalP 3.0 Server 在線分析，沒有發(fā)現(xiàn)其含有信號肽，而在2-20 氨基酸處存在跨膜結(jié)構(gòu)。推導(dǎo)的氨基酸序列中包含有一系列昆蟲細(xì)胞色素P450 基因共有的序列，即螺旋C 區(qū)的保守序列WXXXR(126-130);螺旋K 區(qū)的保守序列EXXRXXP(380-386);以及“Meander”區(qū)域的特征序列PXXFXPXXF (436-444);而血紅素結(jié)合區(qū)的細(xì)胞色素P450 標(biāo)志性特征序列FXXGXRXCXG 變?yōu)镕GAGPRNCIA (460-469);螺旋I 區(qū)的A/GGXD/ETT/S 變?yōu)锳GYESG (324-329)。應(yīng)用SWISS-MODEL 進(jìn)行孟氏隱唇瓢蟲CYP9Z401 蛋白的同源建模，得到模擬的蛋白三維結(jié)構(gòu)(圖3)，其中有18 個α 螺旋(Helix)，12 個β 折疊(Sheet)，沒有發(fā)現(xiàn)無序蛋白結(jié)構(gòu)(Disordered protein)。

圖1 孟氏隱唇瓢蟲CYP9Z401 基因的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of CYP9Z401 from Cryptolaemus montrouzieri

圖2 孟氏隱唇瓢蟲CYP9Z401 的基因結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Structure of CYP9Z401 cDNA from Cryptolaemus montrouzieri

2.2 昆蟲的CYP9 家族基因同源性和進(jìn)化分析

從NCBI 中找到與孟氏隱唇瓢蟲CYP9Z401 遺傳相似性較高的20種昆蟲的CYP9 基因序列，將孟氏隱唇瓢蟲與已知昆蟲的CYP9 基因蛋白序列比對結(jié)果如下:山松大小蠹Dendroctonus ponderosae CYP9Z19 (AFI45046)43%、赤擬谷盜Tribolium castaneum CYP9Z4 (NP_ 001164248)47%、紅脂大小蠹Dendroctonus valens CYP9Z18 (AGF69216)42%、德國小蠊 Blattella germanica CYP9E2(Q964T2)39%、家蠶 Bombyx mori CYP9A19(BAM73827)41%、蠅蛹金小蜂Nasonia vitripennis CYP9P3 (NP_ 001165945)40%、野桑蠶Bombyx mandarina CYP9A21 (ACJ04711)41%、太平洋折翅蠊 Diploptera punctata CYP9E1 (AAR97606)38%、果蠅 Drosophila mojavensis CYP9 (XP _001999792) 41%、草地貪 蛾 Spodoptera frugiperda CYP9A58 (AID55429)41%、二化螟Chilo suppressalis CYP9A69 (AHW57316)40%、黑腹果蠅 Drosophila melanogaster CYP9F2 (NP _650189)40%、印度刻繭蜂Glyptapanteles indiensis CYP9 (ACE75339) 40%、歐洲熊蜂 Bombus terrestris CYP9E2 (XP_ 003393388)38%、切葉蟻Acromyrmex echinatior CYP9E2 (EGI69987)39%、甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae CYP9 (AAR26518)39%、小蜜蜂 Apis florea CYP9E2 (XP _003697796)38%、棉鈴蟲 Helicoverpa armigera CYP9A14v2 (AID54902) 42%、苜蓿切葉蜂Megachile rotundata CYP9E2 (XP _ 003705491)37%、谷實(shí)夜 Helicoverpa zea CYP9A14(ABH09253)42% (圖5)。從不同目的昆蟲挑選了有代表性的物種:赤擬谷盜、德國小蠊、家蠶、印度刻繭蜂、黑腹果蠅與孟氏隱唇瓢蟲采用Multiple 進(jìn)行比對分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，昆蟲的CYP9 家族基因同源性不高，在37%-47%之間(圖4)。

將上述21種昆蟲的CYP9 基因蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，孟氏隱唇瓢蟲和鞘翅目的赤擬谷盜親緣關(guān)系最近，其次是山松大小蠹和紅脂大小蠹，再次是雙翅目和鱗翅目的昆蟲，與膜翅目和蜚蠊目的昆蟲遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖3 孟氏隱唇瓢蟲CYP9Z401 理論蛋白結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The theoretical three-dimensional structure of Cryptolaemus montrouzieri CYP9Z401 protein

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞色素P450 蛋白的氨基酸序列普遍同源性不高，一般在30%-50%之間，最低不足20%，孟氏隱唇瓢蟲CYP9Z401 與其他20種昆蟲昆蟲的CYP9 家族基因比較，同源性最高的為赤擬谷盜47%，最低的為苜蓿切葉蜂37%。但是，細(xì)胞色素P450 蛋白擁有共有的保守氨基酸序列，越來越多的P450 晶體結(jié)構(gòu)顯示，P450 的結(jié)構(gòu)折疊具有高度保守性(Graham ＆ Peterson，1999)。P450 結(jié)構(gòu)中最保守的部分是圍繞在血紅素周圍的蛋白的中心，該保守中心由螺旋束D、E、I、L，螺旋J、K，2 套β 折疊構(gòu)成。這些區(qū)域包含血紅素結(jié)合環(huán)(heme-binding loop)。血紅素結(jié)合環(huán)位于血紅素的近表面，大部分包含有P450 最具特征的共有序列(FXXGXRXCXG)和絕對保守的半胱氨酸(C)。螺旋K 中絕對保守的EXXRXXP 元件，螺旋C 區(qū)有保守序列WXXXR。螺旋I 的中心部分，該部分包含有P450 的另一個共有序列(A/GGXD/ETT/S)。P450 的可變區(qū)通常與N-端錨定，可以識別不同底物并與之結(jié)合(Gotoh，1992)。

圖4 孟氏隱唇瓢蟲與其他昆蟲CYP9 基因氨基酸序列比較Fig.4 Alignment of the amino acid sequence of insect CYP9 proteins

圖5 與孟氏隱唇瓢蟲CYP9Z401 相關(guān)蛋白的聚合進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of Cryptolaemus montrouzieri CYP9Z401 and other related proteins

自1967年RAY 首先在家蠅Musca domestica 中確定細(xì)胞色素P450 的存在，此后在其他許多昆蟲相繼發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450 基因(劉月峰等，2011)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該基因家族包括36 個基因族(程家安和唐振華，2001)，其中包括昆蟲的4 個家族，分屬于CYP4 、CYP6 、CYP9 和CYP18 家族(Sushmita et al.，1996)。孟氏隱唇瓢蟲CYP9Z401屬于P450 家族中的CYP9 家族。大部分P450 家族基因與昆蟲抗藥性密切相關(guān)，普遍認(rèn)為，細(xì)胞色素P450 介導(dǎo)的昆蟲抗藥性是通過解毒代謝酶基因擴(kuò)增或過量表達(dá)，導(dǎo)致解毒代謝酶的活性顯著升高，解毒代謝能力增強(qiáng)而對殺蟲劑形成抗性(Berge et al.，1998;劉月峰等，2011)。因此，研究昆蟲P450 蛋白的產(chǎn)生、變化可以了解昆蟲對外界環(huán)境適應(yīng)性變化規(guī)律，尤其對于天敵昆蟲的抗藥性機(jī)制的研究，有利于天敵的釋放和評價對害蟲的控制潛能。

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