曾照成，王曉玫

1.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤內(nèi)科，廣東深圳 518001；2.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院病理科，廣東深圳 518001

卵巢癌在婦科腫瘤中死亡率居首位，當(dāng)前卵巢癌患病率呈逐年上升趨勢。由于卵巢癌的發(fā)病隱匿，所以找尋卵巢癌發(fā)病過程中的敏感及特異腫瘤標(biāo)志物極有可能為為卵巢癌臨床診治和轉(zhuǎn)歸提供有價值的生物指標(biāo)[1]。已有研究表明人類組織激膚釋放酶家族(Human kailikrein, KLK)于腫瘤發(fā)生發(fā)展多個過程中都有參與[2]，為研究激肽釋放酶（kallkarein)KLK10 及KLK11 在卵巢癌組織中的表達(dá)，現(xiàn)分析2008年1月— 2013年12月在該院行卵巢手術(shù)且資料完整患者75例的臨床資料，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月—2013年12月在暨南大學(xué)第二臨床深圳市人民醫(yī)院行卵巢手術(shù)且資料完整患者共75例為研究以對象，患者均為初次接受手術(shù)治療,術(shù)前未行放療、化療及其他藥物治療。

實(shí)驗(yàn)分組:良性腫瘤組：卵巢良性上皮腫瘤組織32例，正常卵巢組織18例。卵巢癌組織43例。病理類型：在全部卵巢癌組中惡性腫瘤占43例，年齡40~70 歲。手術(shù)分期是：惡性腫瘤組別，Ⅰ期5例，Ⅱ期11例，Ⅲ期18例，Ⅳ期9例。

1.2 試劑和方法

KLK10，KLK11 兔抗人單克隆抗體購自美國RD 公司，二抗購自美國羅氏公司，DAB 購自美國羅氏公司。

采用免疫組化LDp 法，抗KLKn 的單抗工作濃度均為1:25。①常規(guī)切片脫蠟浸水，通過3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性組織過氧化物酶；②10 min 后室溫下進(jìn)行高壓抗原修復(fù)；③HarriS 蘇木淡染精細(xì)胞核l min，洗片用流水，添加PBS 緩沖液；④加抗KLKll 單抗(工作濃度1:25)，4 ℃過夜；⑤第二日用PBS 緩沖液以沖洗切片3 次，5 min/次； ⑥加Envision TM 試劑,37 ℃孵 箱 內(nèi)20 min；⑦PBS 沖洗3 次，5 min/次；⑧DAB/H2O2顯色，于光鏡下進(jìn)行控制，純水對呈色反應(yīng)進(jìn)行終止；⑨常規(guī)脫水到封片。選擇已知的陽性組織切片作為陽性對照，以PBS 替代抗KLKn 單抗以作空白對照。

1.3 觀察指標(biāo)

Klk10,11 免疫組化結(jié)果和Klk10,11 的定量表達(dá)情況。

1.4 評價指標(biāo)

所有患者KLKll，KLK10 免疫組化的結(jié)果：如果在細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色的反應(yīng)物即判定為陽性表達(dá)。依據(jù)切片中的陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞陽性百分比將結(jié)果區(qū)分為:無表達(dá)(-):檢測切片當(dāng)沒有陽性細(xì)胞;少量表達(dá)(+):檢測切片中陽性細(xì)胞<25%;一般表達(dá)(++):檢測切片中陽性細(xì)胞數(shù)≥25%、<50%;大量表達(dá)(+++):檢測切片中陽性細(xì)胞≥50%。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，染色反應(yīng)灰度值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的均數(shù)比較行t 檢驗(yàn)，多個樣本間的均數(shù)行單因素方差分析，klk10,11 表達(dá)同卵巢癌的惡性程度評估分析使用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Klk10,11 免疫組化結(jié)果

研究結(jié)果顯示：KLK11 都表達(dá)于健康卵巢、卵巢良性腫瘤、卵巢癌上皮組織細(xì)胞的胞質(zhì)與胞核。但根據(jù)數(shù)據(jù)可以看出，卵巢癌組織中klk11 的表達(dá)明顯不如正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）； 卵巢良性腫瘤組織中klk11 的表達(dá)與正常卵巢組織klk11 的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組卵巢組織中klk11 的表達(dá)

由結(jié)果可以看出，Ⅰ/Ⅱ卵巢癌組織中的klk11 表達(dá)陽性率顯著高于Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌組織中的klk11 表達(dá)陽性率，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；G1 級卵巢癌組織中的klk11 表達(dá)陽性率和G2/G3 級卵巢癌組織中的klk11 表達(dá)陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；不同組織學(xué)類型的卵巢癌組織中的klk11 表達(dá)陽性率存在著顯著差異，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 卵巢癌組織中KLK11 表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 卵巢癌KLK10 與KLK11 表達(dá)定量分析

Klk11 于卵巢癌組織中的表達(dá)比它在正常的卵巢組織和良性的卵巢腫瘤組織表達(dá)的水平要低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1；Klk10 于卵巢癌組織中的表達(dá)比它在正常的卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織表達(dá)的水平要低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 各組卵巢組織中KLK10 的表達(dá)

3 討論

人類組織的激肽釋放酶基因(human tissue kallikreins gene，KLKs) 是一組高度保守的基因簇，在腫瘤組織中差異性表達(dá)。KLKs 的生物學(xué)功能主要通過其表達(dá)產(chǎn)物人類組織激肽釋放酶發(fā)揮作用[3]。

該研究應(yīng)用免疫組化方法對KLK11、KLK10 于卵巢癌、卵巢的良性腫瘤和卵巢的正常組織當(dāng)中表達(dá)情況進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明： ①KIKll 與KLK10 蛋白hKn 于卵巢上皮的細(xì)胞當(dāng)中均有表達(dá)； ②KIKll 與KLK10 蛋白hKn 表達(dá)水平同卵巢細(xì)胞良惡性相關(guān)，它們于卵巢癌組織中的表達(dá)比在正常的卵巢組織和良性的卵巢腫瘤組織中表達(dá)要低 {KLK11 （P=0.044）KLK10 (P=0.002)}；③KLK11 與KLK10hKn 表達(dá)水平同卵巢癌臨床分期相，在最初卵巢癌組織中(Ⅰ/Ⅱ期)KLK11 和KLK10hKn 的表達(dá)水平明顯優(yōu)于晚期的卵巢癌(Ⅲ/Ⅳ期){KLK11(P=0.010), KLK10(P=0.032)； ④KLKll 與KLK10hKn 的表達(dá)水平和卵巢癌組織學(xué)類型有關(guān)，KLKll 與KLK10hKll 在漿液性的卵巢癌組織中的表達(dá)與其他卵巢癌的組織類型相比有顯著升高(KLK11:P=0.003，KLK10:P=0.003)。這與已有的研究結(jié)果相類似[4]。

綜上所述，KLK10 和11 有望成為早期診斷卵巢癌的血清標(biāo)志物，考慮到KLK 群的生物學(xué)特點(diǎn)，對它的檢測對于卵巢癌和其他類型播散性腫瘤的區(qū)分十分有益。

[1]Kang WD，Choi HS，Kim SM.value of serum CA125 levers in patients with high-risk,early stage epithelial ovarian cacer[J].Gynecol Oncol，2010，116（1）:57-60.

[2]Evans DG，Gaarenstroom KN，Stirling D.Screening for familial ovarian cancer:poor survival of BRCA1/2 related cancer[J].J Med Genet，2009，46（9）:593-597.

[3]蘇曉峰.Kallikrein7 基因在胃癌中的表達(dá)及其siRNA 對胃癌細(xì)胞增殖的影響[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué),2012.

[4]王煥春.KLK5 在乳腺癌中的表達(dá)及其靶向microRNA 的預(yù)測和驗(yàn)證[D].泰安：泰山醫(yī)學(xué)院,2012.

[5]李利文.KLK15 基因在甲狀腺腫瘤中的表達(dá)和意義[D].鄭州：鄭州大學(xué),2013.

[6]褚芳波,陳英劍,胡成進(jìn)，等.人類組織肽釋放酶在卵巢癌中的表達(dá)及意義[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2014(8):608-611.

[7]李磊.Kallikrein10 的調(diào)控機(jī)制及其腫瘤臨床應(yīng)用的價值[J].中國腫瘤生物治療雜志,2014,21(1):109-113.

[8]吳艷花.人組織激肽釋放酶5 抗體制備及雙抗體夾心ELISA 檢測方法的建立[D].泰安：泰山醫(yī)學(xué)院,2012.