夏祥偉，茅國新

(高郵市人民醫(yī)院，江蘇 揚州225600)

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，在我國及日本發(fā)病率、死亡率均較高，目前其發(fā)、發(fā)展的機制并不十分清楚。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多步驟的過程，主要機制包括原癌基因的激活、黏附機制的失調(diào)及抑癌基因的失活等。補體反應(yīng)基因－ 32(response gene to complement-32，RGC-32)是一種新發(fā)現(xiàn)的補體激活基因，RGC-32 基因的表達異常會導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化，在腫瘤轉(zhuǎn)移浸潤等過程中起關(guān)鍵作用［1］，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤組織中存在RGC-32 的異常表達。鋅指E 盒結(jié)合蛋白(zinc-finger E-box-binding homeobox factor 1，ZEB1)是鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要一員，是胚胎發(fā)育中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是細胞分化和胚胎發(fā)育的重要分子，ZEB1 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。ZEBl 通過多種途徑抑制了E－鈣黏蛋白及其他相關(guān)蛋白的表達，增加多種腫瘤的侵襲和廣泛轉(zhuǎn)移的能力。本研究應(yīng)用免疫組化S-P 法檢測RGC-32 及ZEB1 在胃癌、癌前病變及癌旁正常胃黏膜組織中的表達情況，并分析兩者與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2011年1月至2013年12月高郵人民醫(yī)院收治的術(shù)后胃癌標本60 例、癌前病變組織60 例(來源胃鏡組織活檢)及癌旁正常胃黏膜組織20例。所有標本均具有完整的臨床及病理資料。胃癌患者術(shù)前均未接任何抗腫瘤治療。

1.2 方法 標本經(jīng)過質(zhì)量分數(shù)4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 切片，然后采用免疫組化S-P 法進行RGC-32 和ZEB1 的表達，所用一抗為兔抗人RGC-32和ZEB1 抗體，操作按照說明進行，用已知RGC-32 和ZEB1 陽性組織作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果評判標準 雙盲法隨機計數(shù)1 000 個細胞，計算出陽性細胞所占比例，陽性反應(yīng)程度根據(jù)陽性細胞所占比例進行分級。

RGC-32 陽性信號表現(xiàn)為棕黃色，主要位于細胞膜、細胞質(zhì)中，以陽性細胞的所占比例為標準:每張組織切片隨機抽取10 個視野，每個視野觀察100 個細胞，記錄染色為陽性的細胞數(shù)，最后結(jié)果取各組的平均值，陽性細胞所占的比例換算百分率:0 ～5%為陰性(－)，＞5% ～25%為弱陽性(+)、＞25% ～50%為中等陽性(+ +)、＞50%為強陽性(+ + +)，其中強陽性、中等陽性歸為陽性表達，而弱陽性、陰性歸為陰性表達。

ZEB1 陽性信號為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細胞核和細胞質(zhì)，以陽性細胞所占比例為標準:每張切片隨機抽取10 個視野，每個視野觀察100 個細胞，計算染色為陽性的細胞數(shù)，最后結(jié)果取各組的平均值，陽性細胞所占的比例換算百分率:0 ～5% 為陰性(－)，＞5% ～25%為弱陽性(+)、＞25% ～50%為中等陽性(+ +)、＞50%為強陽性(+ + +)，其中強陽性、中等陽性歸為陽性表達，而弱陽性、陰性歸為陰性表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進行分析，應(yīng)用χ2檢驗對RGC-32 和ZEB1 在胃癌、癌前病變和正常胃黏膜組織中的表達以及兩者與胃癌各臨床病理特征間的關(guān)系進行分析，采用χ2檢驗及Spearman 等級相關(guān)檢驗對兩者在胃癌組織中的相關(guān)性進行分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RGC-32 在不同胃組織中的表達 60 例胃癌組織中47 例陽性表達(78.3%)，60 例癌前病變組織中25 例陽性表達(41.7%)，20 例正常胃黏膜組織中8例陽性表達(40.0%)(χ2=19.269，P ＜0.001)，提示胃癌、癌前病變和正常胃黏膜組織中RGC-32 蛋白陽性表達率逐漸降低。見圖1、表1。

2.2 ZEB1 在胃癌、癌前病變及正常胃黏膜中的表達60 例胃癌組織中陽性表達53 例(88.3%)，60 例癌前病變組織中陽性表達30 例(50.0%)，20 例正常胃黏膜組織中4 例表達陽性(20.0%)(χ2=36.354，P ＜0.001)，提示胃癌、癌前病變和正常胃黏膜中的ZEB1蛋白陽性表達率逐漸降低。見圖2、表1。

圖1 RGC-32 在不同胃組織中的表達(S-P，×400)

圖2 ZEB1 在不同胃組織中的表達(S-P，×400)

表1 RGC-32 和ZEB1 在不同胃組織中的表達

2.3 胃癌組織中RGC-32 和ZEB1 的表達與起臨床病理特征之間的關(guān)系 胃癌組織中RGC-32 和ZEB1的表達與胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P ＜0.05)。見表2。

2.4 不同胃組織中RGC-32 和ZEB1 表達的相關(guān)性胃癌組織中RGC-32、ZEB1 同時陽性47 例，同時陰性7 例，RGC-32 陽性而ZEB 陰性0 例，RGC-32 陰性而ZEB1 陽性6 例。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，RGC-32 和ZEB1 在胃癌組織中的表達呈正相關(guān)(r =0.568，P ＜0.001)。

癌前病變組織中RGC-32 和ZEB1 同時陽性20例，同時陰性25 例，RGC-32 陽性而ZEB1 陰性5 例，RGC-32 陰性而ZEB1 陽性10 例。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，RGC-32 和ZEB1 在癌前病變組織中的表達呈正相關(guān)(r=0.452，P ＜0.001)。

正常胃黏膜組織中RGC-32 和ZEB1 同時陽性3例，同時陰性11 例，RGC-32 陽性而ZEB1 陰性5 例，RGC-32 陰性而ZEB1 陽性1 例。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，RGC-32 和ZEB1 在正常胃黏膜組織中的表達無明顯相關(guān)(r=0.336，P=0.110)。

3 討論

胃癌是我國發(fā)病率、死亡率較高的惡性腫瘤之一，但是其發(fā)生、發(fā)展的機制目前并不十分清楚。RGC-32是一種新發(fā)現(xiàn)的補體激活基因，RGC-32 基因的異常表達會促進細胞轉(zhuǎn)化，RGC-32 的異常表達在人類多種腫瘤組織中。RGC-32 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用不明確，更多的研究尋找其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。ZEB1 可以降低IL-2、p73、GATA-3、collagenI/Ⅱ等基因的表達，并可通過負性調(diào)控E－鈣黏蛋白的表 達，增強腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

表2 胃癌組織中RGC-32、ZEB1 表達與其臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系

人類RGC-32 基因位于13q14.11，與白鼠類RGC-32 蛋白具有92%的同源性［1－2］，RGC-32 表達在人類多種組織和器官中，參與多種細胞生物學(xué)過程，是新發(fā)現(xiàn)的補體激活基因［3－5］。RGC-32 在不同腫瘤中的作用各異，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制不明確。Zhu 等［6］研究報道，RGC-32 在胰腺癌組織中的表達明顯高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織，同時發(fā)現(xiàn)其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)(P 均＜0.05)，認為RGC-32 是胰腺癌的轉(zhuǎn)移促進因子之一，在研究中還發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中RGC-32 的陽性表達率和E－鈣黏蛋白的陽性表達率呈正相關(guān)(r =0.458，P ＜0.01)，猜測RGC-32 參與了胰腺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，從而促進其侵襲和轉(zhuǎn)移。Fosbrink 等［7］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中RCC-32 蛋白的表達上調(diào)更為顯著，他發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中RGC-32 蛋白的表達水平明顯增高。Vlaicu 等［8］發(fā)現(xiàn)高表達RGC-32 與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。體外實驗［9］發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的RGC-32 蛋白通過NF-κB 信號途徑促進肺癌細胞的侵襲和發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。研究［10］發(fā)現(xiàn)RGC-32 的過表達促進細胞骨架重組，有利于細胞運動，推測細胞骨架重組是RGC-32 促進腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機制。

研究［6］發(fā)現(xiàn):RGC-32 在胰腺癌、慢性胰腺炎及正常胰腺組織中均有表達，其表達于胰腺腺泡細胞的細胞質(zhì)中，染色均一，呈棕褐色，RGC-32 在胰腺癌組織中的染色強度最強，陽性表達率高于慢性胰腺炎及正常胰腺組織。胃癌組織及正常胃組織中RGC-32 表達部位目前尚未見報道，研究顯示其在人類很多腫瘤中都有表達，然而其在腫瘤形成及發(fā)展中的作用機制仍存在爭議，一方面，有報道稱，在多發(fā)性骨髓瘤、子宮內(nèi)膜癌、侵襲性前列腺癌等腫瘤組織中RGC-32 表達下降，提示其為抑癌基因［4］;另一方面，在胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、乳癌等腫瘤組織中表達上調(diào)，提示為癌基因，體外研究證實RGC-32 在胰腺癌細胞介導(dǎo)TGF-β 誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，提示其為癌基因［6－7，11］。本研究發(fā)現(xiàn):正常胃組織、癌前病變組織、胃癌組織中的RGC-32 陽性表達率逐漸增高，其可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。RGC-32 蛋白的陽性表達與胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P 均＜0.05)，提示RGC-32 的表達參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

ZEB1 是鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一，也是胚胎發(fā)育中所必須的轉(zhuǎn)錄因子。ZEB1 是細胞分化和胚胎發(fā)育的關(guān)鍵影響因素，ZEB1 的表達在腫瘤生物學(xué)中起重要作用，抑制E－鈣黏蛋白表達，增加腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。ZEB1 在多種腫瘤組織中高表達，如乳腺癌、骨轉(zhuǎn)移性小細胞肺癌、肝癌等，且高表達預(yù)示著較差的預(yù)后。Jia 等［12］運用免疫組化S-P法分別檢測45 例胃癌、癌旁正常胃黏膜組織中ZEB1的表達，結(jié)果提示:胃癌組織中ZEB1 的陽性表達率明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，進一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，ZEB1 蛋白的表達在低分化癌組織和TNM 高分期組織中明顯升高。本研究結(jié)果提示:正常胃黏膜組織、癌前病變組織、胃癌組織中的ZEB1 陽性表達率逐漸增高，說明ZEB1 可能參與了正常胃黏膜組織至胃癌的發(fā)生、發(fā)展演變過程。ZEB1 蛋白的陽性表達與胃癌的病理分化程度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P 均＜0.05)，提示ZEB1 的表達與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。RGC-32 與ZEB1 在胃癌中的關(guān)系目前尚未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)兩者在胃癌組織、癌前病變組織中的表達呈正相關(guān)關(guān)系，提示RGC-32 和ZEB1 可能通過某個中間產(chǎn)物共同介導(dǎo)胃癌細胞的癌變、侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，RGC-32 和ZEB1 與胃癌細胞的癌變、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，聯(lián)合檢測RGC-32 和ZEB1 蛋白的表達，對胃癌的早期診斷及判斷腫瘤的惡性程度、預(yù)后有重要作用。探索以RGC-32 和ZEB1 為靶點的治療，為胃癌的治療提供一條新思路。但是，有關(guān)RGC-32 與ZEB1 在胃癌組織中的表達與臨床預(yù)后的具體關(guān)系有待進一步隨訪觀察。

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