朱美琴，夏俊賢，徐 敏，陳亦欣，申維璽

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院、深圳市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東 深圳518020)

肺癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總病例數(shù)的75% ～85%，由于其缺乏明顯的早期臨床癥狀，確診時(shí)患者往往已經(jīng)處于進(jìn)展期，總手術(shù)切除率低，且對放療、化療不敏感，生存時(shí)間短、死亡率高［1］。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)靶向治療的出現(xiàn)為非小細(xì)胞肺癌患者帶來了一線希望，以吉非替尼、厄洛替尼為代表的EGFR 酪氨酸激酶抑制劑對部分非小細(xì)胞肺癌患者有著快速、顯著的療效［2］。但部分復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者無法獲得病理組織進(jìn)行檢測。我們用熒光定量PCR 法檢測了2012年10月至2014年6月在深圳市人民醫(yī)院住院的90 例非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織和血漿EGFR 表達(dá)，并分析兩者的一致性，同時(shí)觀察了血漿EGFR 水平對非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2012年10月至2014年6月在深圳市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科住院經(jīng)組織病理確診的初治晚期非小細(xì)胞肺癌患者90 例，其中男58 例，女32 例;年齡44 ～79 歲，中位年齡50 歲。其中用于EGFR 基因突變檢測的標(biāo)本包括:肺癌手術(shù)切除標(biāo)本(肺癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、轉(zhuǎn)移組織)25 例、組織學(xué)小活檢標(biāo)本(肺穿刺活檢、氣管鏡活檢等)65 例。同時(shí)取得該90例患者的外周血標(biāo)本。

1.2 檢測方法

1.2.1 DNA 的提取 使用德國QIAGEN 公司的DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求來提取人類基因組DNA。

腫瘤組織基因組DNA 的提取:將新鮮的腫瘤組織在液氮中研磨成粉，稱取50 mg 置于115 mL 離心管中提取基因組DNA，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

外周血游離DNA 的提取:抽取10 mL 靜脈血，靜置于EDTA 抗凝管6 h，析出血漿，吸取上層血漿，以12 000 r·min－1離心10 min，連續(xù)3 次，吸取上清液200 μL，提取血漿游離DNA，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 EGFR 突變檢測 采用人類EGFR 基因突變熒光PCR 檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司)檢測EGFR 的突變，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.3 質(zhì)量控制 控制PCR 和測序反應(yīng)假陽性的質(zhì)量控制體系:1)DNA 提取過程中增加無樣品空白對照;2)PCR 擴(kuò)增過程中分別增加一個(gè)陽性質(zhì)控品和一個(gè)陰性對照(自制純化水)。

1.3 結(jié)果判定 人類EGFR 基因突變熒光PCR 檢測試劑盒反應(yīng)結(jié)束后，確定樣品各個(gè)反應(yīng)管的突變Ct值，并確定該樣品的外控Ct 值。Ct 值=突變Ct 值－外控Ct 值。Ct 值低于26 為陽性，高于26 為陰性。

1.4 隨訪和療效評價(jià) 隨訪內(nèi)容:患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤分期、治療方案、轉(zhuǎn)移器官數(shù)目、內(nèi)臟侵犯情況、無疾病進(jìn)展時(shí)間、生存時(shí)間等。所有患者治療前后均行CT 或超聲檢查，然后按照WHO(1981年)制定的實(shí)體瘤客觀療效評定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評價(jià)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier 法，比較采用log rank 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血漿與腫瘤組織EGFR 突變表達(dá)的一致性 90例非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤組織中共檢測到29 例EGFR 突變，其中25 例患者血漿EGFR 可檢測到突變。分析血漿與腫瘤組織中EGFR 突變表達(dá)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌患者的血漿與腫瘤組織中EGFR 突變是一致的。見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者血漿與腫瘤組織EGFR 突變表達(dá)的關(guān)系 n(%)

2.2 血漿EGFR 突變表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系 血漿EGFR 突變表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。見表2。

表2 血漿EGFR 突變表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系 n(%)

2.3 生存情況 全組90 例非小細(xì)胞肺癌患者均獲全程隨訪，隨訪時(shí)間6 ～24 個(gè)月，中位隨訪期12.5 個(gè)月。隨訪截止時(shí)間為2015年1月。隨訪期內(nèi)，全組生存21 例，死亡69 例，均死于腫瘤進(jìn)展。中位無疾病進(jìn)展時(shí)間為5.2(0 ～13)個(gè)月，中位生存時(shí)間11(3 ～24)個(gè)月。

按血漿EGFR 突變表達(dá)情況分為2 組，突變組的中位無疾病進(jìn)展時(shí)間4.3(0 ～10)個(gè)月，無突變組6.2(0 ～13)個(gè)月。無突變組中位無疾病進(jìn)展時(shí)間高于突變組，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

突變組的中位生存時(shí)間為10.2 個(gè)月，無突變組為11.5 個(gè)月。經(jīng)log rank 檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，突變組與無突變組的總生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討論

EGFR 靶向治療的出現(xiàn)為非小細(xì)胞肺癌患者帶來了一線希望，以吉非替尼、厄洛替尼為代表的EGFR 酪氨酸激酶抑制劑對部分非小細(xì)胞肺癌患者有著快速、顯著的療效，這些患者的無疾病進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間得到顯著延長［3］。EGFR 是一種蛋白酪氨酸激酶受體，人類的EGFR 基因位于7 號(hào)染色體的p13 ～q22 區(qū)，全長200 kb，包括28 個(gè)外顯子，其中外顯子19的缺失突變與外顯子21 的點(diǎn)突變占所有EGFR 突變的85% ～90%［4］。

進(jìn)展期肺癌患者一般通過支氣管鏡下活檢、CT 定位下肺穿刺、胸腔鏡下活檢獲取組織標(biāo)本進(jìn)行病理診斷，但是這些操作創(chuàng)傷大且獲取的腫瘤組織標(biāo)本量少，很難有足夠量的腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR 基因突變的檢測。而實(shí)體腫瘤(包括肺癌)患者的血液循環(huán)中存在游離的腫瘤DNA，其來源主要是腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA 釋放入人體外周血，經(jīng)腫瘤組織來源的循環(huán)DNA 中基因變異與循環(huán)血中DNA 相一致，且腫瘤患者外周血游離DNA 含量比正常健康人增高10 倍［5］，其遺傳特性與腫瘤基因組DNA 相同，可以作為組織檢測EGFR 突變困難的晚期肺癌患者的補(bǔ)充標(biāo)本采用。

董強(qiáng)剛等［6］曾對國內(nèi)文獻(xiàn)進(jìn)行了綜合分析，揭示我國非小細(xì)胞肺癌中EGFR 基因突變的發(fā)生率為34.0%(134/394)。而近年來大量研究［7］亦證明了可以從肺癌患者的外周血中檢測到EGFR 突變，且與腫瘤組織的突變情況基本一致。本研究的90 例晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，腫瘤組織EGFR 突變患者為29例，約占全部患者的32. 2%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符。本研究從患者的外周血中檢測到的EGFR 突變亦與腫瘤組織的突變情況基本一致。

目前我國臨床醫(yī)生選擇應(yīng)用EGFR 酪氨酸激酶抑制劑一般遵循腺癌、非吸煙、女性等臨床指征，然而實(shí)踐證明單憑臨床特點(diǎn)進(jìn)行篩選還是存在一定的盲目性。郭琛等［8］認(rèn)為腫瘤組織和外周血中EGFR 突變表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、病理類型無關(guān)。而孫曉軍等［9］則認(rèn)為血漿EGFR 突變多發(fā)生于肺腺癌患者中。本研究采用熒光定量PCR 法分析了90 例非小細(xì)胞肺癌患者血漿EGFR，發(fā)現(xiàn)EGFR 突變表達(dá)與病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，結(jié)果與之前的報(bào)道類似。外周血EGFR 是肺癌患者腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA 釋放入人體外周血，而腫瘤負(fù)荷大的患者更容易釋放出游離腫瘤DNA。

在本研究中，我們并沒有發(fā)現(xiàn)血漿EGFR 突變與無疾病進(jìn)展時(shí)間、生存時(shí)間的長短相關(guān)，這個(gè)結(jié)論跟Ciledag 等［10］的結(jié)果是一致的。而王勇等［11］分析了術(shù)前外周血EGFR 與生存情況的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)術(shù)前EGFR 高表達(dá)組的生存時(shí)間較低表達(dá)組顯著縮短。

綜上所述，本研究通過對90 例非小細(xì)胞肺癌患者血漿EGFR 和腫瘤組織EGFR 突變表達(dá)情況的檢測，發(fā)現(xiàn)兩者之間有較好的一致性。并且血漿EGFR 突變表達(dá)與病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究的結(jié)果不支持以血漿EGFR 突變表達(dá)作為非小細(xì)胞肺癌患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。因此仍需加大樣本量進(jìn)一步的研究。

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