許秀洪,吳春曉，王　嬌(綜述)，周國平(審校)

(南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州 510515)

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腦缺血/再灌注損傷細胞凋亡中JNK信號通路及抑制劑SP600125的作用

許秀洪△,吳春曉△，王嬌△(綜述)，周國平※(審校)

(南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州 510515)

摘要：c-jun氨基末端激酶(JNK)信號轉(zhuǎn)導通路是細胞內(nèi)作用蛋白網(wǎng)絡的重要一環(huán)，參與胞外信號從細胞表面轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)部的過程，可被多種因素激活，在細胞的增殖與分化、形態(tài)維持、骨架構(gòu)建和細胞凋亡等生物反應過程中發(fā)揮重要作用。腦缺血/再灌注損傷導致的細胞凋亡與絲裂原活化蛋白激酶家族有密切的關系，其中JNK信號通路是腦缺血/再灌注損傷中神經(jīng)元凋亡進程的主要機制之一。大量實驗提示，JNK信號轉(zhuǎn)導通路及其抑制劑SP600125在腦缺血/再灌注損傷誘導的細胞凋亡中起重要的調(diào)控作用，應用JNK阻斷劑可起到神經(jīng)保護作用，通過對這些信號轉(zhuǎn)導通路的組成及調(diào)節(jié)機制的研究，有望為臨床上腦缺血疾病的治療提供新的分子治療靶點。

關鍵詞:腦缺血/再灌注損傷；絲裂原活化蛋白激酶信號通路；c-Jun氨基端激酶信號通路；細胞凋亡

腦缺血是導致人類死亡和殘疾的最常見原因之一，目前已知腦梗死后50%以上的梗死血管可以自發(fā)再通，而再通后的再灌注損傷的機制一直是研究的熱點，當各種原因?qū)е碌木植磕X組織區(qū)域血液供應障礙并恢復血流再通時，腦內(nèi)的細胞受到這種缺血/再灌注的刺激后產(chǎn)生一系列病理生理反應,如細胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性氨基酸發(fā)生毒性作用、自由基大量生成、炎性細胞因子產(chǎn)生損傷、相關基因表達異常等[1-2]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號轉(zhuǎn)導通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉(zhuǎn)導通路中重要的通路之一，參與多種生理病理過程，在腦缺血/再灌注損傷細胞的程序性死亡過程中JNK信號通路也起重要的調(diào)節(jié)作用[3]?，F(xiàn)就JNK信號通路的機制在腦缺血/再灌注過程中的作用及阻制劑的應用進行綜述。

1細胞凋亡與MAPK家族

在缺血/再灌注后2～4 d后會引起海馬、皮質(zhì)等區(qū)域神經(jīng)元的細胞死亡，這種現(xiàn)象稱為遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。各種實驗證明，腦缺血/再灌注損傷所引起的遲發(fā)性神經(jīng)元的死亡主要是通過細胞凋亡完成的[4-5]。細胞凋亡是由于細胞受到各種因素刺激而激發(fā)細胞自身自殺程序的一種死亡方式，這種死亡方式受到細胞內(nèi)活性基因、酶和信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控，是細胞主動死亡的過程，也稱程序性死亡。實驗表明，MAPK級聯(lián)途徑參與腦缺血/再灌注損傷，在細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導方面起關鍵性作用，有細胞質(zhì)和細胞核聯(lián)系樞紐之稱[6]。在真核生物中，MAPK家族中最具特征的主要通路如下。①細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路：對酪氨酸激酶受體、生長因子受體反應。②p38MAPK通路：對熱休克、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)等反應。③JNK信號通路：對 TNF-α、IL-1和熱激反應等反應[7]。在腦缺血/再灌注時這三條主要信號通路均被激活。JNK是MAPK級聯(lián)途徑中的一條重要通路，在腦缺血/再灌注損傷中神經(jīng)元的凋亡進程中起重要的調(diào)節(jié)作用[8]。

2JNK信號通路概述

JNK是應激激活的蛋白激酶之一,是進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的重要成員，于1991年提出，當時研究者用紫外線照射細胞后，一種蛋白激酶能使c-Jun 氨基末端活性區(qū)絲氨酸第63和第73位發(fā)生磷酸化，因此把該蛋白激酶命名為JNK,至今研究發(fā)現(xiàn)JNK存在10個異構(gòu)體，編碼JNK信號轉(zhuǎn)導通路的基因包括jnk1、jnk2和jnk3[9]。這三個基因通過選擇性剪切形成相對分子質(zhì)量為46 000 的JNK1α、JNK2α和54 000的JNK1β、JNK2β以及48 000 的JNK3α、57 000的JNK3β。JNK3由于有一個擴展的N端，其相對分子質(zhì)量要比相對應的JNK1和JNK2大，因此JNK3主要特異表達在心臟、腦、睪丸等部位，而JNK1和JNK2廣泛表達于各組織中[10]。

JNK信號通路主要參與細胞骨架構(gòu)建、細胞形態(tài)維持，細胞增殖與分化、細胞惡變和細胞凋亡等各種生物學反應。其中JNK參與的細胞凋亡作用主要是缺血/再灌注損傷的機制之一。經(jīng)典的JNK信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)細胞凋亡，大致模式歸納為：胞外刺激-生發(fā)中心激酶-JNK上游信號促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK)-促分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)激酶-JNK-下游靶基因-細胞凋亡，其中胞外刺激主要是指JNK信號通路可被表皮生長因子、細胞因子(TNF-α、IL-1)、應激(如滲透壓、氧化損傷、電離輻射和熱休克)及G蛋白偶聯(lián)受體激活[11]。胞外的刺激進一步激化了JNK的上游信號，即MAPKKK-MAPKK，MAPKKKs 激酶主要包括ASKs、MEKKs、MLKs、TAK等，MAPKKs 包括MKK4、MKK7。其中MKK4、MKK7兩者均為雙特異性激酶，對蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化具有選擇性，研究表明單獨敲除MKK4或MKK7基因可部分喪失應激刺激后的JNK激活，同時敲除兩個基因則JNK完全不能激活[12]。通過JNK激酶的一系列激活后，JNK信號通路主要通過以下兩條途徑作用于下游靶細胞進而導致細胞凋亡。①外源性途徑(死亡受體途徑)：通過磷酸化c-Jun氨基末端第63與第73位的絲氨酸并將JNK從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，進而活化c-Jun和激活轉(zhuǎn)錄因子2激活轉(zhuǎn)錄因子復合物活化蛋白1(activator protein-1,AP-1)，誘導多種凋亡蛋白表達，如腫瘤壞死因子、Bax、p53、FasL等，使表達增強,導致細胞凋亡，主要通過上調(diào)凋亡蛋白促進細胞凋亡。②內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)：主要通過參與線粒體介導細胞的凋亡通路，活化的JNK通過刺激下游底物改變線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的通透性，通過磷酸化B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)進而促進線粒體釋放細胞色素C，從而激活胱天蛋白酶9-胱天蛋白酶3(caspase9-caspase3)級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡[13]。

3JNK信號轉(zhuǎn)導通路在腦缺血損傷神經(jīng)元凋亡中的作用

腦缺血/再灌注損傷后JNK激活引起腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞延遲性死亡的作用機制目前主要存在以下兩種：①通過線粒體途徑的激活引起細胞色素C、Smac的釋放，進而激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3引起凋亡；②通過轉(zhuǎn)錄和翻譯后機制活化的JNK激活c-Jun/AP-1后引起凋亡相關基因表達的變化，如Bbax、Bim基因等[14]。也有研究表明[15],腦缺血/再灌注損傷后廣泛的MAPK的激活引起細胞炎性介質(zhì)的釋放和表達量的上調(diào)，如IL-1、TNF-α等。它們在腦缺血/再灌注損傷后引起強烈的炎癥反應，破壞細胞膜的完整性，引起細胞的死亡和凋亡。田艷霞等[16]對大鼠進行可逆性大腦中動脈栓塞模型，采用免疫印跡法檢測大腦缺血/再灌注大鼠海馬區(qū)磷酸化c-Jun及凋亡caspase-3表達,結(jié)果表明腦缺血/再灌注誘導了磷酸化c-Jun的早期表達，其中在腦缺血/再灌注3 h表達明顯增加，一直持續(xù)到12 h仍高于正常基礎水平，提示在腦缺血/再灌注損傷中存在JNK的過度激活，在實驗進行到12～24 h階段也可發(fā)現(xiàn)逐漸增加的凋亡細胞出現(xiàn)在海馬CA1區(qū)，進一步證明JNK信號通路的激活可誘導神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡的結(jié)論。王寧等[17]觀察假手術(shù)組、缺血/再灌注組大鼠JNK信號通路JNK表達的比較發(fā)現(xiàn)，海馬CA1區(qū)磷酸化c-Jun在缺血/再灌注組表達明顯,于再灌注2 h時明顯升高,6 h時稍有降低,后逐漸上升，24 h表達到高峰。Okuno等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈線栓法后1 h大腦中動脈區(qū)活化JNK增加，運用JNK選擇性抑制劑SP600125，采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)染色及相關凋亡DNA片段分析，發(fā)現(xiàn)SP600125抑制了腦缺血/再灌注誘導的神經(jīng)元凋亡，而且可以阻斷細胞凋亡因子Bax從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體，表明JNK的激活可以導致腦缺血后的神經(jīng)細胞凋亡。同樣，Gao等[19]使用小鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型，應用蛋白免疫印跡技術(shù)和檢測酶活性的方法發(fā)現(xiàn)JNK在腦缺血/再灌注損傷后活性發(fā)生變化，應用蛋白免疫印跡技術(shù)定量分析發(fā)現(xiàn)在腦缺血/再灌注后30 min磷酸化MKK4和磷酸化c-Jun的表達量都顯著提高，一直到腦缺血/再灌注后24 h才恢復到對照組水平。研究也表明，JNK的下游底物c-Jun的磷酸化在腦缺血/再灌注1 h后增高，在腦缺血/再灌注后1 d其活性仍然較高,說明局灶性腦缺血/再灌注損傷后激活了MKK4/JNK/c-Jun信號轉(zhuǎn)導通路。

4JNK抑制劑SP600125在腦缺血損傷中的作用

SP600125為2001年發(fā)現(xiàn)的一種JNK的競爭性ATP特異性抑制劑，又稱為Anthrapyrazolone，分子質(zhì)量為220.23，可溶解于二甲基亞砜(溶解度約為15 000 mg/L)，不溶于水，能阻斷所有亞型JNK的催化區(qū)域，可逆性地抑制JNK活性，對JNK的抑制要比對細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1和p38的抑制高300多倍，可顯著抑制c-Jun磷酸化，抑制TNF-α、干擾素γ、 環(huán)加氧酶2和IL-2等的表達[20-21]。曹磊等[22]應用四血管阻斷法建立大鼠腦缺血模型，造模前用SP600125抑制劑作預處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)SP600125處理后的大鼠凋亡細胞數(shù)目顯著低于腦缺血/再灌注組，說明抑制劑對神經(jīng)元損傷具有保護作用?？v雪梅等[23]通過測定海馬Bax和Bcl-2蛋白表達陽性細胞數(shù)量、CA1區(qū)存活錐體細胞數(shù)量，結(jié)果顯示，經(jīng)阻滯劑處理后存活細胞數(shù)和Bcl-2陽性錐體細胞數(shù)較腦缺血/再灌注組多，Bax陽性錐體細胞數(shù)目增加較少，推斷阻制劑SP600125能保護神經(jīng)元，且可能是通過調(diào)控Bax和Bcl-2的蛋白表達實現(xiàn)的。Chen等[24]發(fā)現(xiàn)，JNK的磷酸化在海馬水平表達升高，而這種激酶的磷酸化可被JNK抑制劑SP600125抑制，也證實JNK特異性抑制劑SP600125對短暫腦缺血/再灌注誘導的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡的保護作用。Guan等[25]在大鼠的全腦缺血/再灌注模型中應用抑制劑SP600125，明顯減少腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡，推測SP600125通過減少磷酸化的c-Jun和FasL的表達，抑制Bcl-2的磷酸化和Bax從蛋白二聚體Bcl-2/Bax的釋放，減弱Bax轉(zhuǎn)位到線粒體以及細胞色素C的釋放并且抑制細胞凋亡的效應器caspase-3而起作用。王寧等[26]應用SP600125抑制大鼠全腦缺血模型后JNK的活性發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血/再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的數(shù)目顯著較對照組少，存活神經(jīng)元的數(shù)目顯著較對照組多，其機制可能為降低了DNA修復蛋白X線修復交叉互補蛋白1的表達來維護DNA修復功能，而減少神經(jīng)元的凋亡。Benakis等[27]在大鼠腦缺/血再灌注模型建立3 h后應用JNK抑制劑減少缺血/再灌注后48 h梗死體積下降約15.9 mm3。Gao等[19]應用局灶性腦缺血/再灌注模型研究發(fā)現(xiàn),JNK在腦缺血后30 min至24 h活性增加，分別應用SP600125后不但減弱JNK活性，而且也顯著減少腦缺血后腦梗死灶的面積，同時顯著改善大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能評分及感覺功能障礙，另外發(fā)現(xiàn)再增加SP600125的應用劑量以及在腦缺血后2 h以上應用SP600125對腦梗死灶體積的減少效果均不顯著。在腦缺血前30 min在側(cè)腦室注射JNK的抑制劑后能顯著減少腦梗死灶的體積[從(45.3±11.4) mm3減少到(25.2±9.1) mm3]。以上的研究都說明，JNK抑制劑在腦缺血/再灌注損傷中有神經(jīng)保護作用，目前JNK在腦缺血/再灌注損傷中的神經(jīng)保護方面的作用機制尚未完全闡明，但是應用JNK阻斷劑抑制其活性從而達到神經(jīng)保護作用的目的。

5結(jié)語

缺血性腦卒中是威脅人類生命的高致殘、致死性疾病，關于缺血性腦損傷的機制和防治措施一直是研究的熱點和重點。在腦缺血/再灌注時，JNK信號轉(zhuǎn)導通路被激活，雖然有研究提示JNK信號轉(zhuǎn)導通路在腦缺血/再灌注損傷過程中的作用是雙向的，但多數(shù)實驗證明應用JNK阻斷劑可以起到神經(jīng)保護作用，因此通過對這些信號轉(zhuǎn)導通路的組成及調(diào)節(jié)機制的研究，有望為臨床上腦缺血疾病的治療提供新的分子治療靶點。

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Effects of JNK Signaling Pathway and SP600125-JNK Inhibitor in Apoptosis on Brain Ischemia ReperfusionXUXiu-Hong,WUChun-xiao,WANGJiao,ZHOUGuo-ping.(SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:c-Jun N-terminal kinase (JNK) signal pathway is one of the most important aspects of protein network in the cell and participates in the extracellular signal transduction from the cell surface to the internal process,could be activated by a variety of factors and played a role in cell proliferation and differentiation,cell maintaining,skeleton building and apoptosis.Cerebral ischemia-reperfusion injury would cause apoptosis,which are closely related with the MAPK family.Besides,JNK signaling pathway is one of the main mechanisms of neuronal apoptosis process which caused by cerebral ischemia-reperfusion injury.Many studies show that JNK signal pathway and SP600125-JNK inhibitor plays an important regulation role in in apoptosis on brain ischemia reperfusion.Experimental results demonstrate that the application of JNK inhibitor may play a neuroprotective effect.To study the composition and regulation mechanisms of these signaling pathways,which are expected to provide new molecular therapeutic targets for the clinical treatment of cerebral ischemic diseases.

Key words:Cerebral ischemia-reperfusion injury; Mitogen-activated protein signaling pathway; c-Jun N-terminal kinase signal pathway; Apoptosis

收稿日期：2014-05-04修回日期：2014-08-25編輯：鮑淑芳

基金項目：國家自然科學基金(81173355)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.09.007

中圖分類號:R332； R322.61

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)09-1554-03