張婷婷 ，王 蘋，張建偉 ，吳惠燕

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122）

乳腺增生病的發(fā)生、發(fā)展是乳腺上皮細(xì)胞增殖過度和凋亡減弱共同作用的結(jié)果。研究［1］證實絲裂原激活蛋白激酶／細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK／ERK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?；罨軌?qū)е录?xì)胞喪失凋亡和分化的能力，促使細(xì)胞異常增殖。通過調(diào)控信號傳導(dǎo)途徑治療腫瘤、防止癌變，已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點。我們通過實驗觀察當(dāng)歸芍藥散加味方對乳腺增生模型大鼠乳腺組織中ERK蛋白表達(dá)的抑制作用和乳腺組織形態(tài)變化，探討其可能的機(jī)制。

1 材 料

1.1 動物及分組50只SPF級SD雌性健康未孕大鼠，體質(zhì)量（198.58±6.78）g，上海市西普爾必凱實驗動物有限公司提供，福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心代購，許可證號：SCXK（滬）2008－0016，合格證號：2008001601331。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組10只，實驗組40只。造模30d后，實驗組再隨機(jī)分為模型組、當(dāng)歸芍藥散加味方組、乳癖消組，每組10只。實驗場所在福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SYXK（閩）2009－0001。

1.2 藥物和試劑 ① 當(dāng)歸芍藥散加味方（自擬）：當(dāng)歸15g，白芍15g，川芎8g，茯苓10g，白術(shù)15g，澤瀉10g，浙貝母12g，柴胡8g，香附12g，丹參15g。將生藥經(jīng)蒸餾水浸泡1h，文火煎煮2次，每次60min，取汁合并，4層紗布過濾2次，70℃～80℃水浴濃縮至240%濃度的藥液（含生藥2.4g／mL），冰箱儲存?zhèn)溆?。②苯甲酸雌二醇注射液?mL：2mg）。③黃體酮注射液（20mg／mL）。④乳癖消片（0.32g／?！?0粒）。⑤10%水合氯醛溶液。⑥S－P試劑盒，ERK抗大鼠，蘇木素染色，中性樹膠，多聚賴氨酸。

2 方 法

2.1 造模方法 除正常對照組外，其余3組用雌、孕激素序貫法造模，按體質(zhì)量0.5m g／（k g／d）于大鼠后肢后外側(cè)肌肉注射苯甲酸雌二醇，每日1次，左右交替，連續(xù)25d；繼而用黃體酮注射5m g／（k g／d），每日1次，連續(xù)5d。正常對照組肌肉注射生理鹽水0.1m L／只，每日1次，連續(xù)30d。

2.2 給藥方法 模型組與正常對照組大鼠按1 m L／（k g／d）生理鹽水灌胃；治療組用當(dāng)歸芍藥散加味方制成湯劑，按24g／k g的生藥提取液灌胃30d；乳癖消組按成人劑量9粒（2.88g／d）的6.25倍，即0.3g／k g乳癖消片以生理鹽水研磨配成混懸液灌胃30d。

2.3 標(biāo)本采集 4組大鼠灌胃30d后，禁食24h，處死大鼠并經(jīng)乳頭向基底部最大面積取下第二、三對乳房，標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，待做組織學(xué)觀察和免疫組化檢測。

2.4 檢測方法

2.4.1 病理學(xué)觀察 常規(guī)取材、固定、脫水、石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察乳腺組織切片的組織學(xué)變化。

2.4.2 ERK檢測 用S－P法檢測乳腺上皮組織ERK蛋白表達(dá)。乳腺組織一部分切片脫蠟水化，20 g／m L蛋白酶K消化20min，3%H2O2阻斷，加入ERK一抗過夜，按S－P試劑盒要求步驟進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，干燥封片。

2.5 結(jié)果判定

2.5.1 病理學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察4組大鼠乳腺小葉、腺泡、導(dǎo)管、纖維組織增生情況。

2.5.2 ERK表達(dá) 在光學(xué)顯微鏡下ERK蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞核和（或）細(xì)胞漿著棕黃色，任選取5個最佳視野進(jìn)行拍照，將照片在同一條件下用美國MediaCybernetics公司專業(yè)圖片分析軟件Image－ProPlus6.0進(jìn)行免疫組化光密度測定，取上述5個視野的均值為該檢測樣本的ERK平均光密度值。

3 結(jié) 果

3.1 4組ERK表達(dá)比較 見表1。

表1 4組ERK表達(dá)比較（±s）

表1 4組ERK表達(dá)比較（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與乳癖消組比較，3）P＜0.05。

組 別 大鼠／只 ERK／%1013.39±1.74模 型 組 1041.98±3.481）乳癖消組 1028.86±2.061）2）當(dāng)歸芍藥散加味方組 1022.48±3.101）2）3）正常對照組

3.2 乳腺組織變化 空白對照組：乳腺小葉比較少見，乳腺小導(dǎo)管及腺泡上皮細(xì)胞未見增生；乳腺間質(zhì)未見纖維組織增生；皮膚附件基本正常，見圖1。模型組：乳腺組織出現(xiàn)明顯的增生，乳腺小葉體積增大，分葉增多，腺泡數(shù)目增多，管腔中可見脫落的上皮細(xì)胞及其分泌物，纖維組織增生。證明乳腺增生造模成功，見圖2。乳癖消組：乳腺組織增生程度較輕，乳腺導(dǎo)管上皮排列基本規(guī)則，腺泡腔和腺導(dǎo)管腔無擴(kuò)張，腔內(nèi)分泌物較少，小葉體積縮小，小葉中腺泡數(shù)減少，纖維結(jié)締組織增生減輕，見圖3。當(dāng)歸芍藥散加味方組：乳腺組織輕度增生，乳腺導(dǎo)管上皮排列基本規(guī)則，未見明顯的腺泡腔和腺導(dǎo)管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)分泌物減少，小葉體積縮小，小葉中腺泡數(shù)也明顯減少，纖維結(jié)締組織增生明顯減輕；皮膚組織附件基本正常，見圖4。

4 討 論

4.1 ERK表達(dá)的意義 實驗結(jié)果顯示，乳腺增生大鼠模型中存在著ERK的陽性表達(dá)，給藥30d后當(dāng)歸芍藥散加味方組和乳癖消片組ERK的陽性表達(dá)率減弱，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05），當(dāng)歸芍藥散加味方組優(yōu)于乳癖消片組。提示乳腺增生存在著ERK的陽性表達(dá)，當(dāng)歸芍藥散加味方能抑制模型大鼠乳腺組織ERK陽性表達(dá)。

4.2 當(dāng)歸芍藥散加味方的組方與作用機(jī)理分析

當(dāng)歸芍藥散出自張仲景的《金匱要略》，治療肝脾失調(diào)、血郁濕滯的腹痛。方由當(dāng)歸、白芍、川芎、茯苓、澤瀉、白術(shù)組成。方中重用白芍配當(dāng)歸、川芎以調(diào)肝；茯苓、澤瀉、白術(shù)健脾除濕以治脾。全方使肝血足則氣條達(dá)，脾運(yùn)健則濕邪除。本實驗在原方基礎(chǔ)上加了浙貝母、柴胡、香附、丹參4藥，浙貝母苦寒，開泄力大，化痰散結(jié)作用較強(qiáng)，常用于瘀結(jié)阻滯之病。一味丹參功同四物，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛消癰作用。柴胡疏肝解郁、理氣止痛，柴胡與香附相配增強(qiáng)疏肝解郁之功，緩解乳房疼痛的癥狀，使氣機(jī)調(diào)暢，肝郁得舒；化痰除濕，使脾氣健運(yùn)，生化有權(quán)，從而達(dá)到調(diào)整全身臟腑的功能；佐以活血化瘀、散結(jié)止痛之品，使得痰濕瘀之邪去除，緩解乳房局部癥狀，標(biāo)本兼顧。從實驗結(jié)果看，乳腺增生模型大鼠中存在ERK的陽性表達(dá)，當(dāng)歸芍藥散加味方可以降低模型大鼠乳腺組織ERK蛋白表達(dá)。文獻(xiàn)［2］認(rèn)為處于活化狀態(tài)的MAPK通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、血管新生相關(guān)因子的活化，從而打開細(xì)胞增殖、血管新生的開關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增生，此機(jī)理可能是導(dǎo)致乳腺增生病發(fā)生的原因。ERK作為MAPK／ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要蛋白，一定程度上反映了此通路的活化程度。當(dāng)歸芍藥散加味方能夠改善乳腺組織的增生狀態(tài)，其作用機(jī)理可能是通過調(diào)理肝脾，化瘀散結(jié)，抑制活化的MAPK途徑中ERK的高表達(dá)，從而關(guān)閉細(xì)胞增殖及血管新生的開關(guān)，抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖。

［1］高艷艷，吳素慧 .P D 98059對人子宮頸癌細(xì)胞株S i h a增殖和凋亡的影響［J］.中國醫(yī)療前沿，2011，6（2）：38－39.

［2］王娜，宋卓敏，阮氏水 .益氣消癥法對雌激素誘導(dǎo)子宮肌瘤模型豚鼠子宮組織ME K 2、p－ERK蛋白表達(dá)的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33（10）：1408－1411.