范世明，陳 琳，林 婧，于虹敏，黃學城，許 文，3，陳 丹，黃澤豪

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州350122）

三葉青是我國特有的珍稀藥用植物，又名三葉崖爬藤（Tetrastigmahemsleyanum Dielset Gilg），為葡萄科崖爬藤屬植物，主要分布于我國南方的浙江、江西、福建、廣東、廣西、云南、海南、臺灣等省區(qū)，其塊根在民間被廣泛藥用。據(jù)《全國中草藥匯編》中記載：“三葉青，味苦性平。具有清熱解毒，祛風化痰，活血止痛的功效?！保?］據(jù)報道［2］三葉青中的化學成分有黃酮、還原糖、甾類化合物、氨基酸等，其中黃酮是重要的生理活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究表明三葉青總黃酮部位具有抗腫瘤細胞增殖、誘導凋亡等作用［3－5］。文獻［6］表明，三葉青的葉（或全株）在民間也供藥用，如《海南植物志》中記載三葉青全株可用于白喉、風濕性腰痛等?！吨袊参镏尽罚?］中也記載全株供藥用?！杜_灣藥用植物圖鑒》中記載其鮮葉搗碎可以治皮膚?。?］。目前不同產(chǎn)地的三葉青塊根總黃酮含量測定方法已有報道［9－10］，但未見三葉青葉的質(zhì)量評價報道，三葉青地上部分化學成分定性鑒別的結(jié)果表明，黃酮是其主要成分之一［11］。因福建的順昌、泰寧、福安等地已開始大量種植三葉青，有必要建立測定三葉青葉中總黃酮含量的方法，為三葉青葉的品質(zhì)評價提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV 9100紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；SartoriusCPA225 D十萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；KQ－500 E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；

1.2 試藥 三葉青葉2013年8月～12月實地采自福建順昌、泰寧、福安等地，采下葉片（帶葉柄），晾干；部分購自浙江臺州、麗水等地，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤Tetrastigmahemsleyanum Dielset Gilg.的干燥葉。蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110774－201113）；甲醇（德國 Merck公司，色譜純）；水為超純水（美國m illipore公司）；其它試劑為分析級。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品，用甲醇制成每1m L含蘆丁0.402m g的對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 取三葉青葉供試品，粉碎過40目篩，取粉末1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50m L，精密稱定，超聲（250 W，40k H z）處理30min，放冷，精密稱定后用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 總黃酮的顯色方法及測定波長 參考文獻［9］測定方法，精密吸取供試品、對照品溶液各4m L分別置25m L量瓶中，分別加甲醇至10m L，按下述顯色方法顯色：加入15%新鮮配制的亞硝酸鈉溶液1 m L，10%硝酸鋁溶液1m L，搖勻后放置6min，加入10%新鮮配制氫氧化鈉溶液10m L，用甲醇定容，搖勻后放置15min，即得對照品顯色溶液及供試品顯色溶液。上述2種顯色溶液分別以同樣處理的空白顯色體系為參比，在410～800n m波長處掃描，對照品與樣品紫外吸收基本一致，最大吸收波長在500 n m，故選擇500n m為比色測定波長。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、9m L到25m L量瓶中，加甲醇至10m L，制備得不同梯度濃度的對照品溶液，按2.3項顯色，各對照品顯色體系，以同樣處理的空白顯色體系為參比，在500n m波長處測定吸光度，以吸光度A對濃度C進行回歸計算，得線性回歸方程：

A ＝0.0057 C＋0.0410 r＝0.9994

線性范圍為16.08～144.72μg／m L。

2.4.2 精密度試驗 精密移取對照品溶液和供試品溶液各4m L，分別置于25m L量瓶中，按2.3項分別顯色，在紫外分光光度計上連續(xù)測定6次，結(jié)果對照品和供試品顯色產(chǎn)物吸光度的RSD為0.21%、0.27%。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同批三葉青的葉樣品1g，6份，按2.2項制成供試品溶液，精密吸取4 m L，按2.3項顯色，測定吸光度并根據(jù)標準曲線計算，得該批次三葉青中總黃酮平均含量2.69%，RSD 2.09%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密移取對照品溶液和供試品溶液各4m L，分別置于25m L量瓶中，按2.3項顯色處理后，在120min內(nèi)每隔15min測定吸光度。結(jié)果表明，對照品和樣品顯色產(chǎn)物在室溫下120min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率試驗 取重復(fù)性試驗同批次三葉青的葉樣品0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入近似樣品總黃酮含有量的對照品量（蘆丁13.5 m g），按2.2項制成供試品溶液，精密吸取4m L，按2.3項顯色，測定吸光度并根據(jù)標準曲線計算，平行測定6份，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗

2.5 樣品含量測定 精密稱取不同產(chǎn)地三葉青的葉樣品各1g，每批測定3份，按2.2項制成供試品溶液，精密吸取4m L，按2.3項顯色，以相應(yīng)的空白顯色體系試劑為參比，測定吸光度。同時測定各個批次三葉青葉含水量，按干燥品，計算得不同產(chǎn)地三葉青葉中總黃酮含量，結(jié)果見表2。

表2 福建不同產(chǎn)地三葉青葉總黃酮的含量測定

3 討 論

3.1 采用紫外可見分光光度法測定閩產(chǎn)三葉青的葉中總黃酮含量，該方法經(jīng)過方法學考察符合分析要求，方法簡便、準確，適合于三葉青葉的定量分析和品質(zhì)評價，為三葉青葉的進一步開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。

3.2 福建不同產(chǎn)地三葉青葉總黃酮含量測定比較表明不同產(chǎn)地其總黃酮含量差異較大，其中以永泰、大田、閩侯、仙游、漳平的含量較高，達到3%以上，相對高于浙江三葉青主產(chǎn)地，提示閩產(chǎn)三葉青中這些產(chǎn)地品質(zhì)較好，適合開發(fā)利用。

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［2］陳麗蕓，郭素華 .三葉青的化學成分及藥理作用研究進展［J］.浙江中醫(yī)藥大學學報，2012，36（12）：1368－1370.

［3］丁麗，紀其雄 .三葉青抗腫瘤活性部位的篩選研究［J］.海峽藥學，2011，23（12）：46－48.

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［8］張憲昌 .臺灣藥用植物圖鑒［M］.臺中：晨星出版有限公司，2007：201.

［9］范世明，林婧，許文，等 .不同產(chǎn)地三葉青中總黃酮含量的比較［J］.福建中醫(yī)藥大學學報，2013，23（3）：44－45.

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