田 雪，賴文芳，向 青，洪桂祝

（福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122）

胰島素抵抗是2型糖尿病一個(gè)主要特征，在最初階段胰島素和自由基分泌不足引起葡萄糖和脂肪酸調(diào)節(jié)異常［1］。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源蛋白（PTEN）是一種脂質(zhì)磷酸酶，PTEN表達(dá)上調(diào)或活性增強(qiáng)是導(dǎo)致胰島素抵抗的一個(gè)主要發(fā)生機(jī)制，有望作為改善胰島素抵抗的一個(gè)新靶點(diǎn)［2-3］。大黃素化學(xué)名1'3'8-三羥基-6-甲基蒽醌，為蓼科植物虎杖的干燥根莖和根及掌葉大黃根莖的成分之一，具有抗菌消炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用［4-6］。 其抗炎作用可用來防治糖尿?。?］。 本實(shí)驗(yàn)通過質(zhì)粒過表達(dá)PTEN基因來研究大黃素對(duì)PTEN的抑制作用。

1 材 料

1.1 藥品與試劑 大黃素標(biāo)準(zhǔn)品 （上?；示锟萍加邢薰荆?hào)：20111120006，純度≥98%）；小鼠3T3-L1成纖維細(xì)胞 （中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）；RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó) Fermentas公司）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒 （上海碧云天生物技術(shù)研究所）；Qiagen Plasmid Mini Kit（德國(guó) Qiagen 公司，批號(hào)：12123）；RNeasy?Mini Kit（德國(guó) Qiagen 公司，批號(hào)：74104）；小鼠白介素-6 ELISA試劑盒 （武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：EK0555）；PTEN質(zhì)粒（美國(guó) Addgene 公司，批號(hào)：1502）；pCMV Flag WT-PTEN（美國(guó) Addgene 公司，批號(hào)：22231）；EntransterTM-D（北京 Engreen 公司，批號(hào)：4000-1）；PTEN 抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：sc-7974）；β-actin（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：AA128）；地塞米松（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：D1756）；胰島素 （美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)：10305000）；異丁基甲基黃嘌呤（美國(guó) Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：I7018）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 Heracell 150i CO2培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo Fisher公司）；Mini PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽；Mini Trans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽；ChemiDoc XRS＋凝膠成像系統(tǒng)；C1000PCR儀 （美國(guó)Bio-rad公司）；7900HT熒光定量PCR儀 （美國(guó)Applied Biosystems公司）。

2 方 法

2.13T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞用10%小牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

2.23T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 細(xì)胞長(zhǎng)滿至培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)接種到24孔板中，48 h后開始分化。用第1誘導(dǎo)液（10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM，0.5 mM異丁基甲基黃嘌呤，1.0 μg／mL胰島素和1.0 μM地塞米松）培養(yǎng)細(xì)胞48 h，更換為第2誘導(dǎo)液 （10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM，1 μg／mL 胰島素）繼續(xù)培養(yǎng)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)16 d，2～3 d更換1次培養(yǎng)液。電子顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)有油滴聚集，即表示誘導(dǎo)分化成功。 細(xì)胞經(jīng) 10 ng／mL LPS刺激后， 加入 1、10、50 μM濃度的大黃素作用24 h，收集細(xì)胞及其上清液。

2.3 PTEN質(zhì)粒培養(yǎng)與提取 將菌落接種到含100 mg／mL青霉素的大腸桿菌液體培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。按照Qiagen Plasmid Mini Kit試劑盒步驟提取，加100 μL TE緩沖液溶解，-20℃保存。質(zhì)粒 DNA的 A260／A280在 1.80～2.20，純度良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將2 μg PTEN DNA加入含1%胎牛血清的25 μL DMEM混勻，制成DNA稀釋液；將4 μL的EntransterTM-D加入含1%胎牛血清的25 μL DMEM混勻，制成EntransterTM-D稀釋液；將2種稀釋液充分混勻，室溫靜置30 min后，用1%胎牛血清的DMEM稀釋，使質(zhì)粒濃度為2 μg／mL；加入到 24 孔板中，每孔 1 mL，2 h 后加入10 ng／mL LPS、10 μM 的大黃素作用 24 h；陰性對(duì)照組只加入稀釋后的EntransterTM-D，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液。

2.5 檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-6含量 利用ELISA法測(cè)定IL-6的含量，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

2.6 Western blot檢測(cè) 提取細(xì)胞蛋白，用10%SDS-PAGE凝膠電泳，90Ⅴ，45 min轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜（PTEN一抗 1∶1000，β-actin 1∶8000），二抗用抗鼠抗體（1∶5000）室溫?fù)u床孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑于凝膠成像系統(tǒng)顯像，Quantity One軟件檢測(cè)信號(hào)條帶灰度值。

2.7 RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá) 用QIAGEN RNeasy?Mini Kit提取細(xì)胞總 RNA，測(cè)得 A260／A280 為 1.8～2.0，RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。 重復(fù)檢測(cè)3次，每次做2個(gè)復(fù)孔，計(jì)算2個(gè)復(fù)孔的Ct值，分別以同一個(gè)樣品的18S為內(nèi)參計(jì)算2-ΔΔCt值。引物序列見表1。

表1 PTEN、IL-6、18S基因引物序列信息

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)用（±s）表示。組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

見表2～表4。

表2 大黃素對(duì)PTEN mRNA表達(dá)水平和蛋白含量的影響（±s）

表2 大黃素對(duì)PTEN mRNA表達(dá)水平和蛋白含量的影響（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與 1 μM 大黃素組比較，3） P＜0.05。

PTEN 蛋白 ／β-actin 0.990±0.0640.457±0.122）0.216±0.0562）0.162±0.0412）3）組 別空白組1 μM 大黃素組10 μM 大黃素組50 μM 大黃素組n3333 PTEN mRNA／18S 1.000±0.0000.549±0.1561）0.574±0.0952）0.481±0.0722）

表3 PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后大黃素對(duì)PTEN mRNA表達(dá)水平和蛋白含量的影響（±s）

表3 PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后大黃素對(duì)PTEN mRNA表達(dá)水平和蛋白含量的影響（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與質(zhì)粒組比較，3） P＜0.01；與 10 μM 大黃素組比較，4） P＜0.05。

PTEN 蛋白 ／β-actin 1.000±0.0410.980±0.0752.507±0.1051）0.674±0.0522）1.235±0.0713）組 別空白組陰性對(duì)照組質(zhì)粒組10 μM 大黃素組質(zhì)粒＋大黃素組n44444 PTEN mRNA／18S 1.000±0.0000.969±0.1564.047±0.4721）0.578±0.0662）1.479±0.2573）4）

表4 PTEN質(zhì)粒作用后IL-6 mRNA和上清液中IL-6的變化（±s）

表4 PTEN質(zhì)粒作用后IL-6 mRNA和上清液中IL-6的變化（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05，2）P＜0.01；與質(zhì)粒組比較，3） P＜0.05。

IL-6 含量 ／（pg／mL）1.000±0.0000.985±0.0911.878±0.0922）0.716±0.0571）1.399±0.1463）組 別空白組陰性對(duì)照組質(zhì)粒組10 μM 大黃素組質(zhì)粒＋大黃素組n66666 IL-6 mRNA／18S 1.031±0.2500.479±0.0831.342±0.4191）0.336±0.0231）0.264±0.1103）

4 討 論

磷脂酰肌醇3激酶 （PI3K）／Akt通路是胰島素主要信號(hào)傳導(dǎo)通路，PTEN是PI3K／Akt通路公認(rèn)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，抑制PTEN可增加胰島素的敏感性，并改善胰島素抵抗［8］，炎癥在胰島素抵抗的發(fā)展中起到重要作用［9］。結(jié)果表明：大黃素能抑制PTEN的基因和蛋白的表達(dá)。3T3-L1脂肪細(xì)胞經(jīng)PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，使PTEN基因和IL-6過表達(dá)，大黃素作用于經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的脂肪細(xì)胞后，能明顯降低IL-6的含量，明顯降低PTEN基因和蛋白的表達(dá)。大黃素可通過抑制PTEN降低脂肪組織中炎癥因子的釋放，改善胰島素抵抗。

［1］ANAND S，MUTHUSAMY VS，SUJATHA S，et al.Aloe emodin glycosides stimulates glucose transport and glycogen storage through PI3K dependent mechanism in L6 myotubes and inhibits adipocyte differentiation in 3T3L1 adipocytes［J］.Febs Lett，2010，584（14）：3170-3178.

［2］PLANCHON S M.Abrogating the induction of Type 2 Diabetes mellitus secondary to statin therapy［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2014，28（5）：393-394.

［3］BIMBAUM Y，NANHWAN M K，LING S，et al.PTEN upregulation may explain the development of insulin resistance and Type 2 Diabetes with high dose statins［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2014，28（5）：447-457.

［4］沈愛娟，蔡宛如.大黃素抗炎作用及對(duì)急性肺損傷治療作用研究進(jìn)展［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，37（10）：1261-1264.

［5］孫桂斌，張萌，嚴(yán)方，等.大黃素抗腫瘤活性及相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2013，37（6）：248-256.

［6］黃偉鋒.大黃素的藥理作用研究進(jìn)展［J］.柳州醫(yī)學(xué)，2013，26（4）：241-244.

［7］宋冰，劉學(xué)政.大黃素對(duì)2型糖尿病小鼠血糖、胰島素水平的影響及機(jī)制探討［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（38）：32-33.

［8］曹洪義，楊秋，童南偉.PTEN與胰島素抵抗和2型糖尿?。跩］.國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志，2013，33（5）：335-338.

［9］JUNG C，TSAI Y，CHANG C，et al.Allergen exposure induces adipose tissue inflammation and insulin resistance［J］.Int Immunopharmacol，2014，23（1）：104-112.