楊依函，蔣燕群，漆姣媚，張杰，付明，2*

（懷化學(xué)院1.生物與食品工程學(xué)院；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化418008）

超聲波輔助乙醇法提取顯齒蛇葡萄總黃酮的工藝研究

楊依函1，蔣燕群1，漆姣媚1，張杰1，付明1，2*

（懷化學(xué)院1.生物與食品工程學(xué)院；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化418008）

用超聲波輔助乙醇浸提法提取顯齒蛇葡萄葉中總黃酮，以二氫楊梅素為標(biāo)準(zhǔn)品，AlCl3為顯色劑，紫外分光光度法測定總黃酮含量.在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行L9（34）正交試驗，以總黃酮含量為指標(biāo)，分別考察乙醇濃度、料液比、浸提時間和超聲波處理時間對顯齒蛇葡萄總黃酮提取率的影響.結(jié)果表明該方法提取總黃酮的最佳條件是：乙醇濃度65%，料液比為1∶40，浸提時間30min，超聲波處理時間20min.影響總黃酮提取因素的主次順序為乙醇濃度、超聲波處理時間、料液比和浸提時間，在最佳工藝下測得總黃酮含量為41.25%.

顯齒蛇葡萄；超聲波輔助乙醇法；黃酮；二氫楊梅素

顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）主要分布于粵、滇、貴、湘、鄂、贛、閩等海拔200～1 500 m的山地、灌木叢中，尤其適合在陰濕環(huán)境中生長.亦稱藤茶、田婆茶等.其味甘甜，性涼，具有清熱解毒、抗氧化、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血壓、降血脂、保肝護肝等功效.民間將其幼嫩莖葉制成保健茶，用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、皰癤等癥已有數(shù)百年的歷史［1］，是一種典型的藥食兩用植物.顯齒蛇葡萄中含有大量的黃酮類化合物，其中主要是二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）.研究表明，藤茶中總黃酮含量高達43.61%［2］，其中僅DMY的含量就高達39.5%［3］.

黃酮類化合物具有抗氧化［4］、清除自由基［5］，降血糖［6］、降血脂［7］，抗腫瘤［8］、抗抑郁［9］等作用，同時對各類肝損傷均有不同程度的保護作用［10，11］.顯齒蛇葡萄中黃酮含量極高，具有開發(fā)潛力.但王家勝等測定不同產(chǎn)地顯齒蛇葡萄中二氫楊梅素含量時沒有篩選最佳提取工藝，曾云想等在用超聲波提取總黃酮時沒有考察超聲波處理時間對黃酮提取率的影響，我們以DMY為標(biāo)準(zhǔn)品，在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交實驗以確定超聲波輔助乙醇法提取顯齒蛇葡萄總黃酮的最佳工藝，為進一步開發(fā)利用該植物提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料于2013年5月25日采自湖南省懷化洪江市，經(jīng)懷化學(xué)院劉勝貴教授鑒定為顯齒蛇葡萄.

DMY標(biāo)準(zhǔn)品（四川食品藥品檢驗所，批號100080－200306）、AlCl3（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、石油醚（成都市科龍化工試劑廠）、無水乙醇、95%乙醇（天津市富宇精細化工有限公司），以上試劑均為分析純.

1.2 儀器設(shè)備

JY99－IID智能型超聲波細胞粉碎機、Beckman DU800紫外/可見光分光光度計、AL104型電子天平、FW177型中草藥粉碎機、SW－420－2S型恒溫水箱、CS101－IE電熱鼓風(fēng)干燥箱.

1.3 方法

1.3.1 材料處理

取經(jīng)清水洗凈并剪切的顯齒蛇葡萄放入干燥箱中，于65℃下干燥后用粉碎機粉碎并過60目篩，密封干燥保存.

1.3.2 測定波長的確定［12］

稱取顯齒蛇葡萄粉末2.0 g置于索氏提取器中，用適量石油醚回流30 min，棄石油醚；溫水浴中揮發(fā)殘留石油醚.再加100 ml 95%的乙醇回流提取1 h，過濾后定容至100 ml.取適量樣品液稀釋至2.0 mg/ml.

取100μg/ml的DMY標(biāo)準(zhǔn)液、2.0 mg/ml的樣品液和蒸餾水各0.2 ml，分別置于10 ml容量瓶中，然后向以上3只容量瓶中各加入3 ml 5%的AlCl3，搖勻靜置10min.以加蒸餾水的溶液為空白，將DMY標(biāo)準(zhǔn)液和顯齒蛇葡萄提取液于200～800 nm處掃描.二者在250～450 nm的吸光值如圖1所示，它們在310 nm處都有最大吸光值，故選310 nm作為測定波長.

圖1 DMY標(biāo)準(zhǔn)液、顯齒蛇葡萄提取液掃描圖

1.3.3 DMY標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［13］

準(zhǔn)確吸取50μg/ml的DMY標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml于6只10 ml容量瓶中，再加入3 ml 5%的AlCl3搖勻，并加95%乙醇定容至刻度，搖勻靜置10 min.以DMY為0的溶液作為空白對照，測其余各管的A310；以A310對DMY含量作圖，并進行線性回歸.

1.3.4 顯齒蛇葡萄黃酮含量的測定

稱取顯齒蛇葡萄粉末1.000 g于50 ml錐形瓶中加入一定體積一定濃度的乙醇溶液，于80℃恒溫水浴中浸提一定時間，再用超聲波處理一定時間后抽濾，把濾液定容至50 ml.取10μl提取液加入3 ml5%的AlCl3搖勻，再用95%乙醇定容至10 ml，靜置10 min后測A310；根據(jù)回歸方程及下列公式計算出黃酮含量：

式中，X：通過回歸方程計算的DMY質(zhì)量（μg）；n：稀釋倍數(shù)；W：所取顯齒蛇葡萄質(zhì)量（g）.

1.3.5 單因素實驗

稱取顯齒蛇葡萄粉末1.000 g于50 ml錐形瓶中進行黃酮類化合物的提取，分別考察乙醇濃度、料液比、超聲波處理時間、乙醇浸提時間四個因素對黃酮提取率的影響.超聲波處理后過濾，定容至50 ml，取一定體積的提取液測A310，然后按公式（1.1）計算黃酮含量.

1.3.6 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以黃酮含量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表對上述四個因素進行正交實驗，并對結(jié)果進行直觀分析和方差分析.為了進一步證實最佳提取工藝，對正交實驗得到的最佳提取條件進行驗證性實驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

DMY標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，當(dāng)DMY濃度在0～12.5μg/ml范圍時，相應(yīng)吸光度在0～0.7464范圍內(nèi)，A310和DMY含量之間存在良好的線性關(guān)系，經(jīng)過線性回歸處理，可得回歸方程為：A＝0.0060X－0.0044，R2＝0.9997.方法學(xué)考察實驗的平均加標(biāo)回收率為100.1%（RSD＝0.68%，n＝5）；DMY對照品和樣品提取液顯色后90 min內(nèi)進行穩(wěn)定性實驗，RSD分別為0.44%和0.51%；精密度與重復(fù)性實驗的RSD分別為0.65%和2.32%，說明該方法符合定量測定要求.

圖2 DMY標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對黃酮含量的影響

分別稱取樣品1.000 g于5只100 ml錐形瓶中，分別加入30 ml 55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液，置于80℃恒溫水浴中浸提30 min，再用超聲波處理15 min后抽濾定容至50ml.取6只10 ml容量瓶，其中一只加入10μl蒸餾水，其余5只分別加入10μl不同乙醇濃度下的顯齒蛇葡萄提取液；再加入3 ml 5%的AlCl3搖勻，用95%乙醇定容至10 ml，靜置10 min后測A310；根據(jù)回歸方程及公式（1.1）計算出黃酮含量，結(jié)果如圖3.

圖3 乙醇濃度對黃酮含量的影響

由圖3可以看出：樣品中黃酮含量與乙醇濃度成正比，但是在乙醇濃度＞65%之后，直線的斜率明顯變小，原因可能是隨著乙醇濃度的增加，揮發(fā)程度增加，高濃度的乙醇對黃酮物質(zhì)的溶出并無多大作用，考慮到經(jīng)濟效益，因此確定65%為最佳濃度.

2.2.2 料液比對黃酮含量的影響

分別稱取樣品1.000 g于5只100 ml錐形瓶中，向每只錐型瓶中分別加入10、20、30、40、50 ml 65%的乙醇溶液（即由2.2.1確定的最佳乙醇濃度），搖勻后置于80℃的恒溫水箱中浸提30 min，再用超聲波處理15 min，然后按2.2.1方法測定不同料液比下顯齒蛇葡萄提取液中的黃酮含量，結(jié)果如圖4.

圖4 料液比對黃酮含量的影響

由圖4可以看出：在料液比為1∶10～1∶30時，黃酮含量隨乙醇用量的增加而顯著升高，在料液比為1∶30時含量最高（41.02%）.再增加乙醇用量，含量反而有所下降，可能是因為一定比例的提取溶劑已經(jīng)能夠完全將顯齒蛇葡萄溶出，再增加溶劑反而溶出更多的雜質(zhì)而影響吸光值.因此料液比為1∶30時黃酮提取率最高.

2.2.3 超聲波處理時間對黃酮含量的影響

圖5 超聲波處理時間對黃酮含量的影響

分別稱取樣品1.000 g于5只100 ml錐形瓶中，并向每只錐型瓶加入30 ml（即由2.2.2確定的最佳料液比）65%的乙醇溶液，搖勻后置于80℃的恒溫水箱中浸提30 min，再用超聲波分別處理0、15、30、45、60 min，然后按2.2.1方法測定不同超聲波處理時間下顯齒蛇葡萄提取液中的黃酮含量，結(jié)果如圖5.

由圖5可知：當(dāng)超聲波處理時間在0～15 min之間時，黃酮含量隨超聲波處理時間的增大而升高，然而當(dāng)處理時間＞15 min后，黃酮得率反而下降，可能是因為超聲波處理的時間過長使得部分黃酮被破壞，從而引起黃酮含量下降，故確定最佳超聲波處理時間為15 min.

2.2.4 乙醇浸提時間對黃酮含量的影響

分別稱取樣品1.000 g于5只100 ml錐形瓶中，并向每只錐型瓶加入30ml65%的乙醇溶液，搖勻后置于80℃的恒溫水箱中分別浸提10、20、30、40、50 min，再用超聲波處理15 min（即由2.2.3確定的最佳超聲時間），然后按2.2.1方法測定不同浸提時間下顯齒蛇葡萄提取液的黃酮含量，結(jié)果如圖6.

圖6 浸提時間對黃酮含量的影響

由圖6可知：在浸提時間10～20 min時，黃酮含量隨著浸提時間的增加而顯著升高.當(dāng)浸提時間＞20 min時，斜率明顯變小，并在浸提30 min時得率最高，而再延長時間時，含量反而有所下降，可能是部分黃酮被氧化，因此浸提時間以30 min為佳.

2.3 正交實驗

為全面考察超聲波輔助乙醇浸提法提取顯齒蛇葡萄黃酮化合物的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素試驗結(jié)果及有關(guān)資料，對上述四因素進行正交試驗設(shè)計，采用L9（34）正交試驗測定顯齒蛇葡萄中黃酮類化合物的含量.各因素水平見表1.分別準(zhǔn)確稱取1.000g樣品于9只100ml錐形瓶中，按表2操作浸提顯齒蛇葡萄黃酮.超聲波處理完成后按2.2.1方法測定不同條件下提取液中的黃酮含量，結(jié)果見表2.

表1 因素水平表

表2 L9（34）正交實驗結(jié)果

由表2可知RA＞RC＞RB＞RD，所以對超聲波輔助乙醇法浸提顯齒蛇葡萄黃酮類化合物工藝的影響程度為A（乙醇濃度）＞C（超聲波處理時間）＞B（料液比）＞D（浸提時間），因素D（浸提時間）的極差最小，數(shù)據(jù)處理時作為最小誤差項.因此確定超聲波輔助乙醇法提取顯齒蛇葡萄黃酮類化合物的最佳提取工藝條件為A2B3C3D2，即加入40倍于干物料65%的乙醇溶液，搖勻后置于80℃的恒溫水浴中浸提30 min，再用超聲波處理20 min.按照所確立的最佳提取工藝參數(shù)進行驗證性實驗，結(jié)果顯齒蛇葡萄中黃酮類化合物平均含量＝（40.05%＋41.87%＋41.84%）/3＝41.25%.

3 討論

提取黃酮化合物的方法主要有有機溶劑、熱水、酶解、CO2超臨界提取、大孔樹脂吸附提取等［14］.熱水提取法的提取率低，有機溶劑提取法存在排污量大的問題，CO2超臨界提取法和酶法投資較大、成本高，大孔樹脂吸附法使有機溶劑難以回收，損耗大、易燃易爆、對環(huán)境污染嚴(yán)重［15］.黃酮類化合物屬細胞內(nèi)產(chǎn)物，在提取時需要將植物細胞破碎，現(xiàn)有的機械破碎法難以將細胞有效破碎，化學(xué)破碎法易使黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)等發(fā)生變化，而超聲波法簡單快捷，提取率高，效果好［16］.

通常采用NaNO2－Al（NO3）3顯色法，以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品測A510從而測得黃酮物質(zhì)的含量，但具有鄰二酚羥基的非黃酮類物質(zhì)在510 nm處也有較強吸收；而黃芩素、山柰酚等黃酮類成分在510 nm處沒有吸收，因此該法不能排除非黃酮類物質(zhì)的干擾，測定黃酮含量的專屬性不強，而AlCl3比色法可以消除非黃酮類物質(zhì)對顯色的干擾［17］.因此，我們以DMY為標(biāo)準(zhǔn)品，采用AlCl3顯色法測定顯齒蛇葡萄黃酮類化合物含量；經(jīng)波長掃描后確定其最大吸收波長為310 nm.

曾云想等比較了微波提取法、超聲波提取法和乙醇回流法發(fā)現(xiàn)微波提取法是提取藤茶黃酮的最佳方法，在中檔微波P50、料液比1∶35、微波處理90s時總黃酮得率達43.61%，但他們沒有考察超聲波處理時間對黃酮得率的影響，結(jié)果可能有出入；王家勝等采用超聲波輔助提取、高效液相色譜法測定不同產(chǎn)區(qū)顯齒蛇葡萄中DMY的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMY的含量有很大差異，在2.50%～39.50%之間，但他們沒有篩選最佳提取工藝.本研究采用超聲波破碎細胞與乙醇浸提相結(jié)合的方法，在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過正交實驗得到最佳工藝為：乙醇濃度為65%，料液比為1∶40，超聲波處理時間為20min，乙醇浸提時間為30min；在最佳提取工藝下，黃酮含量平均為41.25%.不同產(chǎn)地、不同生境下的顯齒蛇葡萄總黃酮成分有區(qū)別，含量差異較大，在實際生產(chǎn)中應(yīng)結(jié)合經(jīng)濟效益，進一步試驗確定其最佳提取工藝.

顯齒蛇葡萄是一種特色食藥兩用植物，其黃酮類化合物具有多種活性，有著廣闊的開發(fā)前景.該提取工藝具有操作簡單、生產(chǎn)成本較低、穩(wěn)定性好、黃酮得率高等優(yōu)點，為開發(fā)顯齒蛇葡萄的黃酮類化合物提供了一定的參考依據(jù).

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Technical Study on the Extraction of Flavonoids from Ampelopsis Grossedentata by the Ultrasonic－Assisted Ethanol Extraction

YANG Yi-han1，JIANG Yan-qun1，QIJiao-mei1，ZHANG Jie1，F(xiàn)UMing1，2*
（1.College of Biological and Food Engineering；2.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources，Huaihua University，Huaihua，Hunan 418008）

The total flavanoids from Ampelopsis grossedentata was extracted by the ultrasonic－assisted ethanol extraction.With dihydromyricetin as standard sample and AlCl3as developer，the amount of total flavonoids was determined by ultraviolet spectroscopy.On the basis of the single factor experiment，we employed L9（34）orthogonal test by using the content of total flavonoids as indicator and further examinewhether or not the ethanol concentration，the ratio of solid to liquid，extraction time and ultrasonic treatment time had an effect on the extraction efficiency of the total flavonoids from ampelopsisgrossedentata.The results indicated that the optimal conditionswere as follows：ethanol concentration 65%，the ratio of solid toliquid 1∶40，extraction time 20 mins.and ultrasonic time 30 mins.In conclusion，these results showed that the ethanol concentration，ultrasonic treatment time，the ratio of solid to liquid and extraction time were major factors affecting the extraction of total flavonoids.Under the optimum condition，the yield of total flavanoidswas41.25%.

ampelopsisgrossedentata；ethanolmethod with the aid of ultrasonic；flavanoids；dihydromyricetin

Q657.3

A

1671－9743（2015）11－0007－05

2015－09－20

湖南省高校創(chuàng)新平臺項目（14K075）；2015年度湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項目（452）；湖南省植物學(xué)重點建設(shè)學(xué)科資助（201142）.

楊依函，1993年生，女，河南鄲城人，2013級生物工程專業(yè)本科生.

*通訊作者：付明，1966年生，女，湖北荊門人，副教授，研究方向：藥用植物的開發(fā)與利用研究.