趙丹，劉長軍，吳磊

（國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)院生物信息研究中心，湖南長沙410073）

少棘蜈蚣候選殺蟲肽κ－SLPTX－Ssm2b的原核表達與純化

趙丹，劉長軍，吳磊*

（國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)院生物信息研究中心，湖南長沙410073）

通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得了與具有昆蟲毒性的少棘蜈蚣毒素κ－SLPTX－Ssm2a高度同源的毒素分子κ－SLPTX－Ssm2b.通過密碼子優(yōu)化并全基因合成獲得了其DNA序列，利用RF－cloning技術(shù)將κ－SLPTX－Ssm2b插入到表達載體pet－HIS－SUMO，通過自動誘導(dǎo)表達技術(shù)在大腸桿菌BL21（DE3）誘導(dǎo)融合蛋白表達，通過鎳柱純化并用Ulp1激酶切割sumo標(biāo)簽并釋放毒素分子，通過MALDI－TOF質(zhì)譜鑒定其分子量為3 390.4658 Da.研究結(jié)果表明獲得了與理論分子量（3391.04 Da）一致的κ－SLPTX－Ssm2b目的毒素分子，其表達產(chǎn)量為2.1mg/L，為進一步研究該候選殺蟲肽分子的生理活性奠定了基礎(chǔ).

原核表達；少棘蜈蚣；κ－SLPTX－Ssm2b；大腸桿菌BL21（DE3）；殺蟲肽

化學(xué)殺蟲劑自發(fā)現(xiàn)以來，在預(yù)防和治理農(nóng)業(yè)林業(yè)害蟲以及傳播病毒的昆蟲方面一直處于霸主的地位.隨著時間的發(fā)展，一些化學(xué)殺蟲劑的毒副作用也逐漸暴露出來，這對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了極大的影響.例如DDT，其穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在生態(tài)環(huán)境中有殘留難以降解，且能夠在動物體內(nèi)富集［1］.研究表明，鳥類體內(nèi)含有DDT會導(dǎo)致其殼蛋變軟無法孵育，在南極洲企鵝體內(nèi)已經(jīng)檢測出DDT的殘留，這無疑對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的威脅［2－5］.由于老舊化學(xué)殺蟲劑對害蟲和生態(tài)系統(tǒng)均有毒害作用，開發(fā)一種具有專一作用于害蟲，但對其他生物以及環(huán)境危害小的新型殺蟲劑就顯得尤為重要.

蜈蚣是典型的肉食性節(jié)肢動物，它的主要捕食對象有蝗蟲、蟑螂、蠅類、蛾類等［6］.在捕食過程中，蜈蚣通過顎爪鉗將毒液注入被捕食者體內(nèi)，使其身體抽搐麻痹而失去反抗能力［6－8］.研究表明，蜈蚣的粗毒中主要成分是蛋白質(zhì)、多肽以及小分子物質(zhì)等［9］.選擇專一性以及易降解的特性，使得蜈蚣毒素成為開發(fā)新型殺蟲藥物的又一選擇.

κ－SLPTX－Ssm2a是一種已經(jīng)從少棘蜈蚣（Scolopendra subspinipesmutilans）毒液中分離純化出的一種多肽毒素，實驗證明極少量的該多肽毒素對蒼蠅、粉虱、蟑螂就有明顯有效的殺蟲活性［10］.由于κ－SLPTX－Ssm2a除了有殺蟲活性外，對哺乳動物的鉀離子電流也有較強的抑制作用，200 nM的該多肽毒素就能使小鼠DRG細胞的鉀離子電流抑制40%［10］.因此篩選一種比κ－SLPTX－Ssm2a副作用低、專一性更強的殺蟲肽顯得尤為必要.κ－SLPTX－Ssm2b與κ－SLPTXSsm2a的序列具有高度同源性，其活性還沒有被鑒定.因此選擇κ－SLPTX－Ssm2b作為研究對象.

κ－SLPTX－Ssm2b中含有三對二硫鍵，在胞質(zhì)表達過程中容易形成包涵體沉淀，表達后還需進行復(fù)性處理［11］，但是將毒素多肽融合SUMO標(biāo)簽表達能夠增加表達的可溶性效果并傾向于正確折疊，無需再對毒素多肽復(fù)性［12－14］.本文通過將κ－SLPTX－Ssm2b與SUMO標(biāo)簽融合，利用大腸桿菌進行異源表達融合蛋白，通過一系列分離純化得到純度較高的樣品，為后續(xù)進行其殺蟲活性研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

pET－HIS－SUMO表達質(zhì)粒、大腸桿菌DH 5α菌種、大腸桿菌BL21（DE3）菌種和Ulp1激酶均由本實驗室保存和制備.KOD－FX PCR酶體系購于東洋紡（上海）有限公司.BDSHYPERSIL C18柱、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和Dpn I酶購于賽默飛世爾科技公司.DNA純化回收試劑盒與質(zhì)粒小提試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司提供.其余試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.2 重組表達載體pET－HIS－SUMO－kappa－SLPTX－Ssm2b的構(gòu)建

從UniProt數(shù)據(jù)庫中獲取κ－SLPTX－Ssm2b的氨基酸序列（如圖1a）（UniProt蛋白接收號：16S7G9），通過JCat軟件（http：//www.jcat.de/）優(yōu)化的E.coli密碼子偏好性的DNA序列（如圖1a）由生工生物工程（上海）有限公司合成.根據(jù)DNA序列和RF－cloning引物設(shè)計原則［15］，設(shè)計了上下游引物（5'－3'）：P－κ－SLPTX－Ssm2b－F：G C TCA CCG TG A A CA G A T CG G TGG TGC TA A A A A CCCA TA C TG TA A A G；P－κ－SLPTX－Ssm2b－R：G A TGG TA CCG T CG A CG TCC TG CA G TTA G A A A CA A CA TG G A CCG TA A.通過RF－cloning反應(yīng)將κ－SLPTXSsm2b的DNA序列無縫插入到pET－HIS－SUMO表達質(zhì)粒中的sumo標(biāo)簽之后.PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像儀紫外成像觀察后，DNA純化回收試劑盒進行產(chǎn)物回收.用Dpn I消化酶消化產(chǎn)物中甲基化的DNA模板，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆進行菌落PCR篩選并DNA測序.

1.3 κ－SLPTX－Ssm2b的自動誘導(dǎo)表達

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入BL21（DE3）感受態(tài)細菌中.自動誘導(dǎo)表達方法及溶液配方按照Studier F.W.的方法［16］.挑取含有重組質(zhì)粒的單克隆至2ml含有100μg/ml氨芐青霉素的ZYM－505培養(yǎng)液中，置于37℃搖床中于220 rpm搖菌5 h，然后以1：1 000的轉(zhuǎn)接比至500 ml含有100μg/ml氨芐青霉素的ZYM－5052自動誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，置于37℃搖床中220 rpm自動誘導(dǎo)表達16 h.

1.4 κ－SLPTX－Ssm2b的鎳柱親和純化與酶切

誘導(dǎo)完后離心收集菌體，用100 ml PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎后離心收集上清.上清過Ni－NTA純化柱，用含有50 mM咪唑的PBS緩沖液洗滌鎳柱5個柱體積，然后用20 ml含有200 mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白，最后用20 ml含有400 mM咪唑的PBS緩沖液徹底洗滌鎳柱.含200 mM咪唑的PBS洗脫液通過超濾脫鹽后，用Ulp1激酶于4℃酶切過夜.

1.5 κ－SLPTX－Ssm2b的反相純化

酶切液通過0.45μm的濾頭過濾，然后上樣至C18柱（BDSHYPERSIL C18），乙腈濃度梯度在30 min內(nèi)從5%增加至35%，以1 ml/min的流速洗脫.收集每一個單峰并凍干，然后于－20℃保存.并通過MALDI－TOF質(zhì)譜儀檢測每個收集峰的分子量.

1.6 κ－SLPTX－Ssm2b的質(zhì)譜鑒定

通過RP－HPLC收集到的每一個分離峰用滅菌水溶解后，與基質(zhì)α－Cyano－4－h(huán)ydroxy－cinnamic acid（CCA）以1：1比例混合，通過Voyager－DETMSTR MALDI－TOF質(zhì)譜儀鑒定其分子量.

2 實驗結(jié)果

2.1 κ－SLPTX－Ssm2b重組質(zhì)粒的構(gòu)建

通過RF－cloning的方法將κ－SLPTX－Ssm2b的DNA序列成功地?zé)o縫插入到pET－HIS－SUMO質(zhì)粒中（如圖1b）.在插入的目的基因多克隆位點的上游是SUMO標(biāo)簽的序列，SUMO上游是一段6 X His組氨酸標(biāo)簽序列和連接序列.組氨酸標(biāo)簽上游是翻譯起始密碼子（ATG），目的基因下游是終止密碼子（TAA）.將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見一條與理論值基本符合的條帶（如圖1c箭頭所示），證明該基因可能插入到表達載體中.對PCR產(chǎn)物回收并用DpnI酶消化甲基化模板后，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌中，通過菌落PCR篩選出陽性克隆.對陽性克隆提取質(zhì)粒并進行DNA測序，得到的重組DNA序列與理論相吻合，證明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功.

2.2 κ－SLPTX－Ssm2b的自動誘導(dǎo)表達和鎳柱純化

分別收集ZYM－505培養(yǎng)液，ZYM－5052培養(yǎng)液，破碎菌體后離心的上清、沉淀，含200 mM咪唑的PBS洗脫液，含400 mM咪唑的PBS洗脫液，Ulp1激酶酶切液進行SDS－PAGE電泳分析（見圖2）.電泳顯示，誘導(dǎo)菌液（圖2，泳道3）比未誘導(dǎo)菌液（圖2，泳道2）多出一條帶，證明融合蛋白經(jīng)自動誘導(dǎo)表達成功.在菌體破碎離心后的上清中（圖2，泳道4）相同位置也有條帶，而在沉淀（圖2，泳道5）中基本無該條帶的存在，證明可溶性表達.先用含有200 mM咪唑的PBS（圖2，泳道6）洗脫，后又用含有400 mM咪唑的PBS（圖2.泳道7）徹底洗脫發(fā)現(xiàn)，含200 mM咪唑的PBS洗脫液中融合蛋白含量最高.將含200 mM咪唑的PBS洗脫液經(jīng)超濾脫鹽濃縮并用Ulp1激酶酶切后（圖2，泳道8），出現(xiàn)兩條條帶，其中一條在3 kD附近（圖2，箭頭所示），與κ－SLPTX－Ssm2b的分子量3 391 Da相符，說明酶切成功.

圖1 重組表達載體pET－HIS－SUMO－kappa－SLPTX－Ssm2b的構(gòu)建

圖2 κ－SLPTX－Ssm2b表達及純化SDS－PAGE圖

2.3 κ－SLPTX－Ssm2b的表達酶切液的RP－HPLC純化與質(zhì)譜鑒定分析

將酶切后的樣品進行RP－HPLC，進一步進行分離純化并獲得目的毒素分子.將23%～35%濃度的乙腈洗脫的單峰（圖3a）分別收集凍干，用MALDI－TOF質(zhì)譜儀檢測其相應(yīng)的分子量.在33%濃度的乙腈洗脫峰（圖3a中箭頭所示）經(jīng)質(zhì)譜檢測分子量為3 390.46 Da（圖3b），與理論分子量3 391.04 Da一致.這說明κ－SLPTX－Ssm2b經(jīng)大腸桿菌BL21（DE3）正確表達并純化得到純度較高的樣品.

圖3 κ－SLPTX－Ssm2b表達酶切液的RP－HPLC純化與質(zhì)譜鑒定分析

3 討論

隨著化學(xué)殺蟲劑的廣泛使用，其副作用逐漸凸顯，對牲畜、人類及生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的損害.多肽毒素具有選擇性高，易于降解等優(yōu)勢，從產(chǎn)毒動物中挖掘殺蟲肽成為下一代殺蟲劑的發(fā)展趨勢.蜈蚣擅長捕食小昆蟲，因此蜈蚣體內(nèi)更可能存在大量作用于昆蟲的毒素.蜈蚣全身可入藥，因此其體內(nèi)毒素對人等高等生物的毒副作用可能相對較低.因此，從蜈蚣毒腺中分離具有殺蟲藥效顯著，且對人、牲畜以及生態(tài)環(huán)境危害小的殺蟲肽的可能性更大.通過數(shù)據(jù)庫比對，我們找到了與κ－SLPTX－Ssm2a同源性較高的κ－SLPTX－Ssm2b毒素分子，由于其在毒腺中的豐度極低，因此只在轉(zhuǎn)錄組中鑒定了其存在.我們選擇了使用原核表達并采取與SUMO融合表達來獲得可溶性且正確折疊的κ－SLPTX－Ssm2b（如圖2，泳道4）.Ulp1激酶可以識別SUMO標(biāo)簽的空間結(jié)構(gòu)，使得其切割方式更加精準(zhǔn)且不產(chǎn)生或錯誤切割多余的氨基酸序列.因此，通過鎳柱純化并使用Ulp1激酶酶切后，可以獲得初步純化的κ－SLPTX－Ssm2b毒素分子.經(jīng)過分辨率更高的RP－HPLC系統(tǒng)，獲得了單一分子的κ－SLPTX－Ssm2b，并通過質(zhì)譜鑒定確定其形成了三對二硫鍵.MALDI－TOF質(zhì)譜結(jié)果顯示多步純化獲得的κ－SLPTX－Ssm2b分子的純度已經(jīng)達到后續(xù)生理活性試驗的要求.本文的研究為后續(xù)的κ－SLPTX－Ssm2b的生理活性檢測試驗起了重要的作用，為將來更多的富含二硫鍵的蜈蚣毒素的原核表達奠定了基礎(chǔ).

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Prokaryotic Expression and Purification ofκ－SLPTX－Ssm2b，a Candidate of Insecticide from Centipede Scolopendra Subspinipes Mutilans

ZHAO Dan，LIU Chang-jun，WU Lei*
（Research Center of Biological Information，National University of Defense Technology，Changsha，Hunan 410073）

Searching NCBIdatabase，κ－SLPTX－Ssm2b was found possessing the similar structure of the toxinκ－SLPTX－Ssm2a，isolated from the centipede Scolopendra subspinipesmutilans，and was speculated asa potential insecticide.The coding sequence was obtained by gene synthesis after codon optimization and was inserted to an expression vector pET－HIS－SUMO，which was then expressed with auto－inductionmethod in the cytoplasm of E.coli strain BL21（DE3）.The fusion protein was purified using Ni－NTA column and digested by Ulp1 protease to release the toxin.The released fragmentwas further analyzed by mass spectrum assay.Itwas demonstrated that themolecular weight of purified fragment（3390.4658 Da）was identical！to its theoretical value（3391.04 Da）.The yield of expression is 2.1 mg/L，which lays the foundation for finding a new insecticidal peptide.

prokaryotic expression；scolopendra subspinipes mutilans；κ－SLPTX－Ssm2b；E.coli BL21（DE3）；insecticide

Q786

A

1671－9743（2015）11－0064－05

2015－09－17

國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)校預(yù)研“離子通道抑制因子的作用機制”（JC13－02－16）.

趙丹，1991年生，女，河南尉氏人，碩士研究生，研究方向：生物多肽毒素.

*通訊作者：吳磊，1981年生，湖南長沙人，副教授，博士，研究方向：計算生物學(xué).