張建，許錦鵬，蔣細旺

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢，430056；2.武漢市第二中學(xué)）

辣椒（Capsicum annuumL.）在我國的種植范圍遍布南北，因其味道鮮美，深受人們喜歡，目前已經(jīng)成為我國栽培面積最大的蔬菜之一。辣椒是一種喜溫作物，生長的最適溫度為24～27℃，在低于12℃或高于30℃時生長發(fā)育緩慢，5℃時生長就完全停止。南方春早熟、秋延后及北方越冬設(shè)施栽培的辣椒，在生長期間經(jīng)常受到不同程度的低溫脅迫，低溫成為冬春季辣椒生長的主要限制因素。辣椒遭受冷害之后，生長勢、光合作用、呼吸作用、干物質(zhì)積累及酶活性均會受到不同程度的影響，嚴(yán)重時整株死亡，周年生產(chǎn)受到限制，生產(chǎn)損失巨大[1]。

目前，關(guān)于提高蔬菜抗寒性方面的研究，大多數(shù)都集中在通過噴施某些植物生長調(diào)節(jié)劑及其他的化學(xué)制劑如脫落酸[2]、表油菜素內(nèi)酯[3]、水楊酸[4]、多效唑[5]、甜菜堿[6]、5-氨基乙酰丙酸[7]、殼聚糖[8]等，來增強蔬菜對低溫脅迫的抵抗力方面。關(guān)于生物有機肥對蔬菜作物抗寒性的影響研究報道較少。

事實上，生物有機肥可以提高肥效、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，而其提高植物抗寒性的作用也已經(jīng)在油菜[9]、葦狀羊茅[10]、茶葉[11]，水曲柳[12]等上得到證實，但有關(guān)養(yǎng)殖廢棄物生物有機肥對提高辣椒抗寒性的影響，尚未見報道。為此，本試驗以辣椒品種超越五號為試材，探討了施用養(yǎng)殖廢棄物生物有機肥對低溫脅迫下的辣椒葉片中細胞膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性的影響，以期為生產(chǎn)實踐中減緩低溫脅迫對辣椒的傷害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試?yán)苯菲贩N為超越五號，由武漢市農(nóng)科院提供；養(yǎng)殖廢棄物生物有機肥 （N 0.87%，P2O50.64%，K2O 1.35%），由武漢江大高新農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；復(fù)合肥用俄羅斯阿康復(fù)合肥（16-16-16）。

1.2 試驗方法

試驗于2014年2～11月在江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院園藝試驗基地進行。采用基質(zhì)盆栽，基質(zhì)為普通棕壤土，含有機質(zhì)11.24 g/kg，堿解氮58.42 mg/kg，有效磷21.22 mg/kg，速效鉀 115.19 mg/kg，pH值6.22。每盆裝基質(zhì)10 kg，每盆種植1株。

試驗共設(shè)計6個處理，M1：復(fù)合肥（無機肥料）22 g/株；M2：生物有機肥 100 g/株；M3：生物有機肥200 g/株；M4：生物有機肥 400 g/株；M5：生物有機肥800 g/株；CK：空白處理，每個處理3次重復(fù)，肥料均作為基肥施入，常規(guī)栽培管理。移栽60 d之后，選擇生長勢一致的植株移入人工氣候室內(nèi)，光強1 400 μmol·m-2·s-1， 光周期為 12 h， 濕度維持在70%，晝/夜溫度為15℃/5℃，共處理10 d。每個處理10株。

1.3 指標(biāo)測定方法

試驗采用電導(dǎo)儀法測定膜透性[13]，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[13]，采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量[13]；測定超氧化物歧化酶（SOD）采用NBT光還原法并稍作修改[14]，測定脯氨酸（PRO）含量采用酸性水合茚三酮法[14]，丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法[15]，過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定參照張志良等[15]的方法略作修改。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003處理并繪制圖表，采用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析（Duncan氏新復(fù)極差法，P=0.05），并對各指標(biāo)作相關(guān)分析。根據(jù)所測數(shù)據(jù)，首先分別求出處理和對照各項指標(biāo)的平均值，參考前人的方法[16]，將原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，求得各指標(biāo)性狀的抗寒系數(shù)，并進行簡單的相關(guān)分析，得出各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下不同施肥處理對超越五號葉片細胞膜透性的影響

圖1 低溫脅迫下不同肥料用量處理對辣椒葉片細胞膜透性的影響

圖2 低溫脅迫下不同肥料用量處理對辣椒葉片可溶性糖含量的影響

圖3 低溫脅迫下不同肥料用量處理對辣椒葉片可溶性蛋白含量的影響

從圖1可知，經(jīng)低溫脅迫后，與對照相比，各處理的電解質(zhì)滲透率均顯著降低。其中M5和M4兩個處理電解質(zhì)滲透率分別比對照組下降了58.12%和45.34%，均達到了顯著差異水平，說明施肥可以顯著降低低溫脅迫過程中辣椒葉片的電解質(zhì)滲透率。M2～M5處理電解質(zhì)滲透率均低于M1處理，其中M5處理與M1處理的電解質(zhì)滲透率相差39.54%，兩者間達到了顯著差異水平，說明生物有機肥比無機肥（復(fù)合肥）在降低電解質(zhì)滲透率方面的作用更強。且在M2～M5處理內(nèi)，隨著生物有機肥施用量的增加，葉片電解質(zhì)滲透率下降，M5處理比M2處理電解質(zhì)滲透率下降30.10%，兩者間也達到了顯著差異水平，說明在適宜的施肥量范圍內(nèi)，生物有機肥的用量跟電解質(zhì)滲透率呈負相關(guān)。

2.2 低溫脅迫下不同施肥處理對超越五號葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和丙二醛（MDA）含量的影響

從圖2～4可知，與對照相比，經(jīng)過低溫脅迫之后，各處理均不同程度提高了葉片中可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸的含量，其中M5處理的可溶性糖含量達到對照的3.9倍，可溶性蛋白含量達到對照的4.9倍，脯氨酸含量達到對照的3.1倍，差異均達到顯著水平，說明施肥可以顯著提高葉片中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸的含量，促進可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸的反饋抑制作用，保證葉片可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸向植物的其他組織器官運輸[18]。

M2～M5處理的可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸的含量均高于M1處理，其中M5處理比M1處理的可溶性糖含量高出1.4倍，可溶性蛋白含量高出1.6倍，脯氨酸含量高出1.0倍，且差異均達到顯著水平，說明比起施用無機肥料，生物有機肥在提高經(jīng)低溫脅迫后辣椒葉片中可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量方面的效果更好。在M2～M5處理內(nèi)，隨著生物有機肥施用量的提高，葉片中可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸的含量也隨之提高，說明生物有機肥用量與葉片中可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸的含量呈正相關(guān)。

從圖5可知，不同施肥處理下，辣椒葉片中丙二醛含量在經(jīng)低溫脅迫后均比對照降低，其中M5處理的丙二醛含量僅占對照的49.47%，差異達顯著水平，說明施肥處理可以有效降低辣椒葉片中丙二醛的含量。M2～M5處理丙二醛的含量均低于M1處理，其中M5處理的丙二醛含量占M1處理的62.13%，差異達顯著水平，說明低溫脅迫下生物有機肥在降低辣椒葉片丙二醛含量方面的作用要優(yōu)于無機肥。在M2～M5處理內(nèi)，隨著生物有機肥施用量的增加，辣椒葉片中的丙二醛含量降低，說明兩者間呈正相關(guān)。

圖4 低溫脅迫下不同肥料用量處理對辣椒葉片脯氨酸（Pro）含量影響

圖5 低溫脅迫下不同肥料用量處理對辣椒葉片丙二醛（MDA）含量影響

圖6 低溫脅迫下不同肥料用量處理對辣椒葉片過氧化物酶活性的影響

圖7 低溫脅迫下不同肥料用量處理對辣椒葉片超氧化物歧化酶活性的影響

2.3 低溫脅迫下不同施肥處理對超越五號葉片SOD、POD活性的影響

從圖6、7可以看出，經(jīng)低溫脅迫處理的辣椒葉片的POD及SOD活性均比對照辣椒葉片顯著提高，其中M5處理的POD活性是對照的2.8倍，SOD活性是對照的2.4倍，差異均達顯著水平，說明施肥處理可顯著提高低溫脅迫下辣椒葉片的POD及SOD活性。M2～M5處理的POD及SOD活性均高于M1處理，其中M5處理的POD活性達到M1處理的1.5倍，SOD活性達到M1處理的1.4倍，從側(cè)面反映出生物有機肥在提高辣椒葉片POD及SOD活性方面的性能要優(yōu)于無機肥。M2～M5處理下，POD及SOD活性均隨著施肥量的增加而提高，說明兩者間存在正相關(guān)關(guān)系。

2.4 低溫脅迫下不同施肥處理下超越五號葉片各生理生化指標(biāo)的相關(guān)分析

通過對辣椒葉片各生理生化指標(biāo)進行相關(guān)分析，可以進一步明確各個指標(biāo)間的協(xié)同變異程度。從表1可知，質(zhì)膜透性與可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、POD和SOD活性呈極顯著負相關(guān)，與丙二醛含量呈顯著正相關(guān)；可溶性糖含量與可溶性蛋白含量、脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)，與丙二醛含量呈顯著負相關(guān)；可溶性蛋白含量與丙二醛含量呈極顯著負相關(guān)，與SOD活性呈極顯著正相關(guān)；脯氨酸含量與SOD活性呈極顯著正相關(guān)，與丙二醛含量呈顯著負相關(guān)；丙二醛含量與SOD活性呈極顯著負相關(guān)，與POD活性呈顯著負相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

植物的細胞膜系統(tǒng)對低溫脅迫十分敏感，當(dāng)植株受到低溫脅迫時，首先受到傷害的就是細胞膜的功能與結(jié)構(gòu)，植株的相對電導(dǎo)率的變化可以顯示膜系統(tǒng)受到傷害的程度，對低溫脅迫起到重要的指示作用[19]。植株在低溫脅迫下，受到的傷害越嚴(yán)重，細胞膜透性就越大，細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲也越多，測到的相對電導(dǎo)率也就越高，相對電導(dǎo)率的大小反映了植株抗寒性的大小。本試驗中低溫脅迫下，施肥處理的辣椒葉片電解質(zhì)滲透率均小于對照，說明施肥處理可以在低溫脅迫下保護細胞膜結(jié)構(gòu)，并且生物有機肥在維持膜結(jié)構(gòu)方面的作用比無機肥更理想。

游離脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖是細胞內(nèi)最有效、最重要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對細胞的滲透調(diào)節(jié)起著舉足輕重的作用。脯氨酸能以游離態(tài)在植物體內(nèi)廣泛存在，并且可在逆境條件下大量積累，其本身的水合能力較強，所以在逆境狀態(tài)下，可以保持細胞的持水性能，穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)，此外，脯氨酸還在降低細胞酸性、增加細胞液濃度等方面起著重要的作用[20]，同時，脯氨酸可以作為酶和細胞結(jié)構(gòu)的保護劑，防止活性氧對膜脂和蛋白質(zhì)的過氧化作用，因而脯氨酸含量的增加，可以降低低溫脅迫對細胞的傷害，提高植株的抗寒性[21]。本試驗中，經(jīng)過施肥處理后，辣椒葉片中的脯氨酸含量顯著高于對照，并且經(jīng)生物有機肥處理的辣椒葉片脯氨酸含量均比經(jīng)無機肥處理的高，說明生物有機肥處理更加有益于辣椒在低溫脅迫下產(chǎn)生脯氨酸來抵御低溫逆境的影響。

Bois等[22]研究表明，植株體內(nèi)的可溶性蛋白含量與抗寒性存在明顯的正相關(guān)關(guān)系?？扇苄缘鞍鬃鳛橹匾哪B透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量增加直接促進細胞束縛水含量的提高、加強細胞的保水力、降低細胞液的冰點、有效防止低溫對細胞的損傷。碳水化合物作為植物體內(nèi)重要的貯藏物質(zhì)，為植物的生長發(fā)育提供能量基礎(chǔ)。

可溶性糖不僅是植物體內(nèi)主要的膜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也直接影響某些有機溶劑的合成，對于逆境中植物的滲透調(diào)節(jié)有十分重要的意義。在低溫脅迫下，淀粉水解酶的活性被激發(fā)出來，淀粉水解速度加快，可溶性糖含量增高，細胞液的濃度也隨之升高，冰點下降，同時也保護脫水的蛋白質(zhì)[23]。因此，可溶性糖與抗寒性之間也同樣具有正相關(guān)關(guān)系，可溶性糖對低溫脅迫下的植株具有很好的保護作用。由本試驗結(jié)果可知，在低溫脅迫下，生物有機肥比無機肥更能促進辣椒葉片中可溶性蛋白和可溶性糖的產(chǎn)生，以保護植株細胞的正?；顒?，維護植株的生長。這可能是因為施用生物有機肥后，土壤結(jié)構(gòu)得到改良、有益菌落迅速增加，促進了植株對養(yǎng)分的吸收，有利于植株體內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖的快速合成運轉(zhuǎn)。

表1 各生理生化指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)

MDA能夠使細胞正常功能紊亂、有害活性物質(zhì)積累、加重細胞膜過氧化程度，它是細胞膜過氧化最重要的產(chǎn)物之一，反映了膜的過氧化程度[24]。通過測定MDA含量可以了解細胞膜的過氧化程度、膜系統(tǒng)的受損害程度及植株抗寒性[25]。MDA含量越高，說明植物組織的抵抗能力越弱，細胞膜受傷害的程度也越高。由試驗結(jié)果可知，在低溫脅迫中，生物有機肥同無機肥均可以在一定程度上減少葉片細胞膜受MDA的毒害作用，從而保證辣椒在低溫下正常生長，并且經(jīng)生物有機肥處理后，植株抵抗MDA毒害的能力顯著強于無機肥。這可能是因為生物有機肥中的養(yǎng)分均衡且全面，可促進辣椒植株發(fā)育，植株機體營養(yǎng)物質(zhì)積累較多，在細胞受到MDA毒害時，自我恢復(fù)能力較強，最終表現(xiàn)出受傷害程度較低。

當(dāng)植株受到低溫脅迫時，體內(nèi)自由基、過氧化物產(chǎn)生和消除的平衡就會被打破，SOD、POD等是膜脂過氧化的酶促防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，在清除ROS的過程中起著十分重要的作用[26]。通過酶促降解超氧化物陰離子自由基產(chǎn)生的H2O2和O2-，維持活性氧代謝的平衡，保護細胞膜結(jié)構(gòu)，在一定程度上緩解或抵御逆境脅迫，可以有效減少低溫脅迫下產(chǎn)生的有害物質(zhì)對植株的傷害，表現(xiàn)出一定的抗逆性[27]，其中SOD是最主要的細胞膜抗氧化物質(zhì)，SOD活性的高低是判斷植物抗性強弱的主要指標(biāo)。從試驗結(jié)果可知，施用生物有機肥更能增強辣椒葉片中的POD和SOD的活性，減輕植株體內(nèi)的氧化作用，平衡植株體內(nèi)活性氧代謝。這可能是因為生物有機肥料中富含的大量生物活性成分被植株利用之后，植株的光合作用增強、植株發(fā)育健壯、植株體內(nèi)的多種酶活性被引發(fā)，集中表現(xiàn)為植株體內(nèi)POD和SOD活性的增強。

抗寒性是一個受多基因控制、多因素影響的復(fù)雜數(shù)量性狀[28]，利用單一指標(biāo)鑒定植物的抗寒性有很多局限性，而且指標(biāo)間還有著一定的相關(guān)性，因此采用單一指標(biāo)很難既準(zhǔn)確又全面地反映植物實際的抗寒性能力的強弱，只有利用多個指標(biāo)進行綜合評價，才能兼顧準(zhǔn)確與全面[29]。本試驗通過對超越五號在低溫脅迫下相關(guān)生理生化指標(biāo)進行測定，結(jié)合相關(guān)分析，得知辣椒葉片的各個抗寒性指標(biāo)之間都存在一定的相關(guān)性，使得反映出來的信息發(fā)生了重疊，除此之外，各個單項指標(biāo)變化幅度的不一致性，也使得用單項指標(biāo)來評價辣椒的抗寒性存在片面性，因此，在評價辣椒的抗寒性時，需要結(jié)合多個指標(biāo)進行。

[1]柴文臣，馬蓉麗，邢國明，等.辣椒耐低溫研究進展[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：85-87.

[2]任旭琴，劉美琴，陳葛亮，等.外源ABA對辣椒抗冷性生理指標(biāo)的影響[J].長江蔬菜，2009（8）：30-32.

[3]Yu J Q,Zhou Y H,Ye S F,et al.2,4-Epibrassinolide and abscisic acid protect cucumber seedlings from chilling injury[J].Journal of Horticultural Science and Biotechnology,2002,77（4）:470-473.

[4]Janda T,Szalai G,Tari I,et al.Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effects of chilling injury in maize（Zea maysL.）plants[J].Planta,1999,208（2）:175-180.

[5]陳文超，楊博智，周書棟，等.3種誘導(dǎo)劑對辣椒幼苗抗寒性的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，37（4）：396-399.

[6]Ashraf M,Foolad M R.Roles of glycine betaine and proline in improving plant abiotic stress resistance[J].Environmental and Experimental Botany,2007,59（2）:206-216.

[7]Ahme K,Yakup K,Ali R D.Enhancing chilling stress tolerance of pepper seedlings by exogenous application of 5-aminolevulinic acid[J].Environmental and Experimental Botany,2010,67（3）:495-501.

[8]姜秀梅，秦勇，郭光照，等.外源物質(zhì)處理對辣椒幼苗抗冷性的影響[J].中國農(nóng)學(xué)報，2013，29（25）：87-92.

[9]徐正華，張曉紅，陳秀斌，等.不同栽培措施對油菜抗寒性的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，31（6）：661-667.

[10]徐艷麗，魯劍巍，周世力，等.有機、無機肥及其配施對葦狀羊茅生長及抗寒性的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2005，22（10）：97-101.

[11]黃海濤，余繼忠，王賢波，等.不同種類基肥對茶樹生長和抗寒性的影響研究[J].茶葉，2012，38（3）：142-145.

[12]付玉嬪.水曲柳苗木抗寒性培育研究[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2003，28（3）：57-61.

[13]李玲，李娘輝，蔣素梅，等.植物生理學(xué)模塊實驗指導(dǎo)[M].北京：科學(xué)出版社，2009.

[14]李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2001.

[15]張志良，瞿偉箐.植物生理學(xué)試驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2003.

[16]周廣生，梅方竹，周竹青,等.小麥不同品種耐濕性生理指標(biāo)綜合評價及其預(yù)測[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（11）：1 378-1 382.

[17]孟凡珍，張振賢，于賢昌.不同生態(tài)型結(jié)球大白菜抗寒性的評價[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，9（4）：35-39.

[18]丁雪梅，苑兆和，馮立娟，等.不同氮素水平對大麗花形態(tài)指標(biāo)及生理特性的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2012，29（4）：592-598.

[19]Damian J A,Donald R O.Impacts of chilling temperatures on photosynthesis in warm climate plants[J].Trends in Plant Science,2001,6（1）:36-42.

[20]劉書仁，郭世榮，劉超杰，等.脯氨酸對高溫脅迫下黃瓜氮化合物含量和硝酸還原酶活性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，27（2）：366-370.

[21]Mills L J,Ferguson J C,Keller M.Cold-hardiness evaluation of grapevine buds and cane tissues[J].American Society for Enology and Viticulture,2006,57（2）:194-200.

[22]Bois J F,Winkel T,Lhomme J P,et al.Response of some Andean cultivars of quinoa （Chenopodium quinoaWilld.）to temperature:Effects on germination,phenology,growth and freezing[J].European Journal of Agronomy,2006,25（4）:299-308.

[23]高京草，王慧霞，李西選,等.可溶性蛋白、丙二醛含量與棗樹枝條抗寒性的關(guān)系研究[J].北方園藝，2010（23）：18-20.

[24]閆亞杰，耿廣琴，李濤，等.月季感染白粉病后葉片抗氧化酶活性與MDA含量的變化[J].甘肅科學(xué)學(xué)報，2010，22（3）：68-71.

[25]Zhang G,Aija R,Tapani R.The electrical impedance spectroscopy of Scots pine needles during cold acclimation[J].Plant Physiology,2002,115（3）:385-392.

[26]Corbineau F,Gay-Mathieu C,Vinel D.Decrease in sunflower seed viability caused by high temperatures as related to energy metabolism,membrane damage and lipid composition[J].Physiol Plant,2002,116 （4）:489-496.

[27]Zhang J L,Cao Z Y,Ma J F.Screening of cold-resistant seedlings of a Chinese wild grape （Vitis piasezkiiMaxim var.pagnucii）native to loess plateau of eastern Gansu province,China,as rootstocks[J].Scientia Horticulturae,2009,122（1）:125-128.

[28]王志泰，馬瑞，馬彥軍，等.利用隸屬函數(shù)法分析胡枝子抗旱性[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境，2013（9）：120-123.

[29]玉蘇甫·阿不力提甫，阿依古麗·鐵木兒，帕提曼·阿布都熱合曼，等.利用隸屬函數(shù)法綜合評價梨砧木抗寒性[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014（3）：121-129.