周麗娟， 申明慧， 李 敏， 殷婷婷， 孫曉燕， 曹 巍*

（1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 鄭州450007；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州450007）

HPLC法測定蒺藜防白緩釋滴丸中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和歐前胡素

周麗娟1， 申明慧1， 李 敏2， 殷婷婷2， 孫曉燕1， 曹 巍1*

（1.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 鄭州450007；2.鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州450007）

目的 采用高效液相梯度洗脫法測定蒺藜防白緩釋滴丸 （蒺藜、防風(fēng)、白芷、當(dāng)歸等）中升麻素苷、5-0-甲基維斯阿米醇苷和歐前胡素的含有量。方法 蒺藜防白緩釋滴丸甲醇提取液分析在Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）上實施；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm。升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷的色譜流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～10 min，15%A；10～20 min，15%→30%A；20～25 min，30%A）；柱溫35℃。歐前胡素的色譜流動相為甲醇-水 （68∶32，V/V）；柱溫30℃。結(jié)果 升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷分別在1.602 0～112.14μg/mL（r=0.999 8）、1.396～139.60μg/mL（r=0.999 9）范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為100.2%（RSD=0.99%）和99.9%（RSD=0.80%）。歐前胡素在0.707 2～70.72 μg/m L（r=0.999 9）范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.4%（RSD=1.0%）。結(jié)論 本法操作簡便，準(zhǔn)確可靠，可用于蒺藜防白緩釋滴丸的質(zhì)量評價。

蒺藜防白緩釋滴丸；升麻素苷；5-0-甲基維斯阿米醇苷；歐前胡素；高效液相色譜法

sode；imperatorini；HPLC

蒺藜防白丸是我院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，多年來用于治療白癜風(fēng)，臨床療效肯定，使用安全。其組方由蒺藜、防風(fēng)、白芷、當(dāng)歸、赤芍、丹參、補(bǔ)骨脂、墨旱蓮、枸杞子、菟絲子、黃芪、豨薟草、甘草和何首烏 （制）14味藥材組成，在此基礎(chǔ)上開發(fā)研究成蒺藜防白緩釋滴丸，鑒于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中以薄層色譜對蒺藜進(jìn)行了鑒別，故不測定蒺藜有效成分。防風(fēng)和白芷是方劑中的主要成分，本實驗采用HPLC梯度洗脫法［1-3］對防風(fēng)中的升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷，白芷中的歐前胡素［4-6］進(jìn)行了測定，為該藥的制劑工藝和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AUW-120D電子分析天平 （日本島津公司）；ML303E分析天平 （梅特勒托利多儀器上海有限公司）；TQX-150 AH超聲波清洗器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；80-2臺式低速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械有限公司）。

蒺藜防白緩釋滴丸 （自制，批號分別為140315、140320、140322、140324）；升麻素苷（批號111522-201310，純度95%）、5-0-甲基維斯阿米醇苷 （批號111523-201208，純度96.4%）、歐前胡素（批號110826-201214，純度99.5%）對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙腈為色譜純（Merck公司）；水為miliQ超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷的測定［7-8］

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫 （0～10 min，15%A，10～20 min，15%→30%A，20～25 min，30%A）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取升麻素苷對照品8.43 mg和5-0-甲基維斯阿米醇苷對照品7.24 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為貯備液。精密量取貯備液1 m L，置10 m L量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，另精密量取5 mL，置10 m L量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液 （含升麻素苷40.050μg/mL、含5-0-甲基維斯阿米醇苷34.900μg/m L）。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 取蒺藜防白緩釋滴丸20丸，研細(xì)，混勻，精密稱取0.8 g，置10 mL量瓶中，加80%甲醇適量，超聲處理 （功率120 W、頻率40 kHz）30 min溶解，放冷，加80%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液的制備 取除去防風(fēng)藥材的蒺藜防白緩釋滴丸組方，按提取工藝提取后，在“2.1.2.2”項下方法制備空白溶液，即得。

2.1.2.4 空白輔料干擾 取制備滴丸的處方量空白輔料，同法制成空白輔料測定液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗 取 “2.1.2”項下制備的對照品和供試品溶液、陰性樣品、空白輔料溶液，在 “2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷理論塔板數(shù)分別為9 255和186 019，兩峰之間及和其他色譜峰均能達(dá)到良好分離，R均大于1.5，空白溶液不干擾測定，見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系試驗 分別精密量取“2.1.2.1”項下的對照品貯備液2.0、1.4、1.0、0.8、0.5 m L，分別置于10 m L量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取對照品溶液2.8、2.0、1.0、0.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成含升麻素苷160.20、112.14、 80.100、 64.080、 40.050、 11.214、8.010 0、4.005 0和1.602 0μg/mL，含5-0-甲基維斯阿米醇苷139.60、97.720、69.800、55.840、34.900、13.960、6.980 0、3.490 0和 1.396 0 μg/mL的溶液。在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，分別以升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度（C）對各自的峰面積 （A）進(jìn)行線性回歸，計算回歸方程，見表1。

2.1.5 最低檢測限和定量限 分別取 “2.1.4”項下最低濃度的溶液，加甲醇依次稀釋進(jìn)樣測定。當(dāng)S/N≥10時，升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷最低定量限分別為0.163 ng、0.138 ng；當(dāng)S/N≥3時，最低檢測限分別為 0.065 ng、0.055 ng。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

表1 升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Tab.1 Resgression equations，correlation coefficients and linearity ranges of prim-O-glucasylcim ifugin and 5-O-methylvisamm iosode

2.1.6 精密度試驗 取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣測定6次，升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷的RSD分別為0.57%和0.49%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、8 h，進(jìn)樣測定，升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷的RSD分別為0.41%（n=6）和0.32% （n=6）。

2.1.8 回收率試驗 取成分含有量已知的滴丸，按 “2.1.1.2”項下方法，取供試品約0.8 g，共9份，各精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加80%甲醇適量。在9個樣品中，分別加入含升麻素苷（180.6μg/m L）的對照品溶液0.6、0.8、1.0 mL，各3份，再分別精密加入5-0-甲基維斯阿米醇苷 （60.72μg/m L）的對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，各3份，超聲處理 （功率120 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，加80%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，計算升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷的回收率。結(jié)果見表2。

表2 升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷回收率試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests for prim-O-glucasylcim ifugin and 5-O-methylvisamm iosode

2.1.9 重復(fù)性試驗 精密稱取滴丸 （140315）6份，按 “2.1.2.2”項下方法制成供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計算每丸中升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷的總含有量為0.034 1 mg，RSD為1.39%。

2.2 歐前胡素的測定

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相甲醇-水（68∶32，V/V）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對照品8.88 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為貯備液 （353.6μg/m L）。精密量取貯備液1 m L，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液（35.36μg/mL）。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取蒺藜防白緩釋滴丸20丸，研細(xì)，混勻，精密稱取0.8 g，置10 mL量瓶中，加90%甲醇適量，超聲處理 （功率120 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，加90%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性樣品的制備 取除去白芷藥材的蒺藜防白緩釋滴丸組方，按提取工藝提取后，按“2.2.2.2”下方法制備空白溶液，即得。

2.2.2.4 空白輔料 同“2.1.2.4”項下制得的空白輔料測定液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取 “2.2.2”項下對照品和供試品溶液、陰性樣品、空白輔料溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，歐前胡素理論塔板數(shù)為14 718，陰性樣品成分不干擾測定，前后雜質(zhì)與歐前胡素分離度分別為2.31和1.55，見圖2。

圖2 歐前胡素測定的HPLC圖譜Fig.2 HPLC ch romatogram s for im peratorin

2.2.4 線性關(guān)系試驗 分別精密量取 “2.2.2.1”項下對照品貯備液2.0、1.0、0.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取對照品溶液1.0、0.5、0.2 mL，分別置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成含歐前胡素70.720、35.360、17.680、3.536 0、1.768 0、0.707 2μg/m L的溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測定，以歐前胡素的質(zhì)量濃度 （C）對峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=40.008 C+ 3.709 5（r=0.999 99，n=6），歐前胡素在0.707 2～70.72μg/mL范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.2.5 最低檢測限和定量限 分別取 “2.2.4”項下最低濃度的溶液，加甲醇依次稀釋進(jìn)樣測定，

當(dāng)S/N≥10時，定量限為1.77 ng；當(dāng)S/N≥3時，最低檢測限為0.47 ng。

2.2.6 精密度試驗 取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣測定6次，結(jié)果RSD為0.39%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣測定，結(jié)果歐前胡素RSD為0.32% （n=6）。

2.2.8 回收率試驗 取成分含有量已知的滴丸，按 “2.2.2.2”項下方法制備樣品9份，分別精密量取70.72μg/mL歐前胡素對照品溶液1.2、1.5、2.0 m L，各3份，分別加入9份樣品溶液中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，在“2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算歐前胡素回收率。結(jié)果見表3。

表3 歐前胡素回收率試驗結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for imperatorini

2.2.9 重復(fù)性試驗 精密稱取滴丸 6份，按“2.2.2.2”項下方法制成供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，計算每丸中含歐前胡素 0.005 59 mg，RSD=1.2%。

2.3 樣品測定 取3批樣品，在“2.1.1”項升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷、“2.2.1”項歐前胡素色譜條件下測定本品，結(jié)果見表4。

表4 含有量測定結(jié)果 （，n=3）Tab.4 Results of content determ ination（，n=3）

表4 含有量測定結(jié)果 （，n=3）Tab.4 Results of content determ ination（，n=3）

批號 升麻素苷/（mg·丸-1）5-0甲基維斯阿米醇苷/（mg·丸-1）歐前胡素/（mg·丸-1）140320 0.032 2 0.002 27 0.005 80 140322 0.032 7 0.002 24 0.005 68 140324 0.031 9 0.002 31 0.005 60

3 討論

3.1 梯度洗脫條件的選擇［9-11］檢測升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷時，發(fā)現(xiàn)升麻素苷在乙腈-0.1%磷酸為15∶85時，tR=8.3 min，但5-0-甲基維斯阿米醇苷的tR=28 min，不利于樣品分析。故等度洗脫10 min后，改為梯度洗脫，增加乙腈的比例，5-0-甲基維斯阿米醇苷的tR=18.2 min，且前后雜質(zhì)均與之得到良好分離，方法學(xué)試驗良好。

3.2 歐前胡素測定波長的選擇 在白芷的提取中，將其主要成分歐前胡素作為檢測指標(biāo)，參考文獻(xiàn)［12］，采用254、300、310 nm作為檢測波長。結(jié)果，254 nm有最大吸收，通過不斷調(diào)節(jié)甲醇-水的比例，當(dāng)比例為68∶32時，方法學(xué)驗證較好，雜質(zhì)能與歐前胡素峰完全分離，精密度好，回收率高。

3.3 樣品提取方法和時間的選擇 選用70%、80%和100%甲醇等超聲提取方法，結(jié)果在測定升麻素苷和5-0-甲基維斯阿米醇苷時，選用80%甲醇超聲提取方便，提取成分對測定無干擾。而在測定歐前胡素時，90%甲醇效果較好。

3.4 超聲時間的選擇 分別超聲處理15、30、45 min，結(jié)果30 min即可將有效成分溶解完全。

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Determ ination of prim-O-glucasylcim ifugin，5-O-methylvisamm iosode and imperatorin in Jili Fangbai Sustained Release Dropping Pills by HPLC

ZHOU Li-juan1， SHEN Ming-hui1， LIMin2， YIN Ting-ting2， SUN Xiao-yan1， CAOWei1*

（1.Translational Medicine Center，Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Zhengzhou 45OOO7，China；2.Department of Pharmacy，Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Zhengzhou 45OOO7，China）

Jili Fangbai Sustained Release Dripping Pills；prim-0-glucasylcimifugin；5-0-methylvisammio-

R927.2

A

1001-1528（2015）12-2655-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.018

2015-04-17

常州四藥臨床藥學(xué)科研基金 （CZSYJJ13026）

周麗娟 （1979—），女，碩士，副主任藥師，從事藥物新劑型和新技術(shù)研究。Tel：（0371）67690341，E-mail：zhou750423 @126.com

*通信作者：曹 巍（1963—），男，教授，從事腫瘤學(xué)研究。Tel：（0371）67690341，E-mail：zxyxzxsysvip@163.com