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        白頭翁總皂苷結(jié)腸定位固體分散體制備

        2015-12-08 08:13:48劉紅寧管詠梅朱衛(wèi)豐陳麗華
        中成藥 2015年12期
        關(guān)鍵詞:吡喃總皂苷白頭翁

        田 力, 劉紅寧, 管詠梅, 朱衛(wèi)豐, 金 晨, 陳麗華, 楊 明,*

        (1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川成都611137;2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌330004)

        [制 劑]

        白頭翁總皂苷結(jié)腸定位固體分散體制備

        田 力1, 劉紅寧2, 管詠梅2, 朱衛(wèi)豐2, 金 晨2, 陳麗華2, 楊 明1,2*

        (1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川成都611137;2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌330004)

        目的 制備白頭翁總皂苷結(jié)腸定位固體分散體。方法 采用溶劑法制備白頭翁總皂苷固體分散體,以體外累計釋放度為評價指標(biāo),采用單因素方法篩選制備工藝及處方,并采用電子掃描顯微鏡 (SEM)、紅外光譜 (IR)對制備的固體分散體進(jìn)行分析。結(jié)果 SEM和IR分析結(jié)果顯示白頭翁總皂苷和Eudragit S100形成了固體分散體。體外釋放度結(jié)果顯示載藥量在20%時指標(biāo)成分在pH 1.0溶液中2 h基本不釋放,在pH 6.8溶液中4 h累積釋放度小于16%,在pH 7.8溶液中2 h累積釋放大于86%。結(jié)論 所制備的固體分散體達(dá)到了結(jié)腸定位的效果。

        白頭翁總皂苷;結(jié)腸靶向;固體分散體;體外釋放度;電子掃描顯微鏡 (SEM);IR

        白頭翁為毛莨科植物白頭翁Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel的干燥根,始載于《本經(jīng)》。功擅清熱解毒、涼血止痢,尤善清大腸濕熱及血分熱毒,為治療熱毒血痢之良藥,是臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的常用藥物[1-2]。近年來,對白頭翁的藥理學(xué)研究證實(shí),白頭翁提取物具有顯著的抗炎、抗氧化以及增強(qiáng)免疫的作用,具備良好的新藥開發(fā)前景[3-5]。臨床上多采用灌腸的方法治療潰瘍性結(jié)腸炎,但患者順應(yīng)性差。白頭翁總皂苷是從中藥白頭翁中提取分離得到的有效部位,但由于水溶性

        差[6],難以溶出,生物利用度低[7],采用普通制劑白頭翁總皂苷在到達(dá)結(jié)腸前已經(jīng)大部分被吸收破壞,使得病變部位濃度較低,影響了藥效的發(fā)揮。采用結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)可以使藥物達(dá)到結(jié)腸后再釋放,增加結(jié)腸部位藥物的濃度,從而提高白頭翁總皂苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效。本研究采用結(jié)腸靶向給藥,擬以EudragitS100為載體,將白頭翁總皂苷制備成固體分散體,利用EudragitS100在pH大于7的條件下才溶解的特性達(dá)到結(jié)腸定位作用,同時白頭翁總皂苷被高度的分散,進(jìn)入結(jié)腸后隨著EudragitS100的溶解而迅速溶出。通過提高結(jié)腸部位藥物的濃度,達(dá)到提高藥效的目的。

        1 材料

        TG328 A型分析天平(德國Sartoius公司);DZF-6050型真空干燥箱 (上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);6390LV-掃描電鏡 (日本電子公司);HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司);Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司);ZRS-8G型智能溶出儀(天津天大天發(fā)科技有限公司);470-傅立葉紅外光譜儀(美國Nicolet公司);MS2000型激光粒度儀(美國馬爾文公司);四兩裝高速中藥粉碎機(jī) (瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司);白頭翁總皂苷 (中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心,批號1306171);常春藤皂苷元3-0-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷對照品 (代號B3,中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心,純度≥95%,批號20141208);Eudragit S100(贏創(chuàng)德固賽公司);甲醇、乙腈為色譜級;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純;雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 體外溶出實(shí)驗(yàn)

        2.1.1 供試品溶液制備 取物理混合物適量,置100 mL錐形瓶中,分別加入pH 1.0、pH 6.8、pH 7.8的溶液20 mL,旋渦10 min,離心,取上清液,0.45μm微孔濾膜過濾,備用。

        2.1.2 色譜條件 phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.60 mm,5μm);流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液 (39∶61);檢測波長203 nm;柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量20μL;理論塔板數(shù)以常春藤皂苷元3-0-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷計不低于5 000。

        2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取常春藤皂苷元3-0-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷對照品 (B3)5.00 mg,置于10 mL量瓶中,甲醇超聲溶解并稀釋至刻度,搖勻,得500.0μg/m L對照品貯備液。分別精密吸取該貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 m L分別置于5 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。按“2.1.2”項(xiàng)條件進(jìn)樣,記錄峰面積 (A),以質(zhì)量濃度 (C)為橫坐標(biāo),峰面積 (A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程A=5.021 2C+12.587;r= 0.999 5。結(jié)果表明對照品在10.0~200.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.1.4 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為30.5μg/mL對照品溶液,于同一天不同時間測定6次并連續(xù)測定3 d。計算日內(nèi)與日間精密度RSD分別為0.89%、0.73%。表明儀器精密度良好。

        2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量供試品溶液10 m L,加入B3對照品5 mg,旋渦使其溶解,加入相應(yīng)溶液稀釋,混勻。平行3份。按“2.1.2”項(xiàng)色譜方法進(jìn)樣測定,計算加樣回收率。結(jié)果在pH1.0、pH6.8、pH7.8的溶液中指標(biāo)性成分 B3的回收率分別為 98.7%、101.3%、100.7%,RSD分別為1.2%、0.89%、0.56%表明方法回收率良好。

        2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按 “2.1.1”項(xiàng)制備供試品,按照 “2.1.2”項(xiàng)色譜條件,分別于0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣,記錄色譜峰峰面積,計算RSD,結(jié)果在pH 1.0、pH 6.8、pH 7.8的溶液中指標(biāo)性成分B3的峰面積RSD分別為1.64%、0.45%、0.53%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.1.7 藥物的溶出度測定 精密稱取白頭翁總皂苷固體分散體及原料藥,采用 《中國藥典》2010年版二部附錄XC溶出度測定法中第二法,即槳法測定。轉(zhuǎn)速50 r/min,溫度(37±0.5)℃,溶出介質(zhì)參照 《中國藥典》2010年版二部附錄XD及XIXD規(guī)定,選擇pH 1.0的稀鹽酸,pH 6.8、7.8的磷酸緩沖液 (PBS),根據(jù)食物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和時間,將白頭翁總皂苷固體分散體及原料藥于pH 1.0的稀鹽酸2 h,pH 6.8的PBS 4 h,并分別于1、2、4 h取樣2 mL,pH 7.8的PBS 2 h,取樣2 m L(同時補(bǔ)加同溫度等量溶出介質(zhì)),以0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液得各供試品溶液。按

        “2.1.2”項(xiàng)色譜條件下測定溶出介質(zhì)中指標(biāo)性成分常春藤皂苷元3-0-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷峰面積,用外標(biāo)一點(diǎn)法計算濃度,并換算成累積溶出度。累100%其中Cn為各時間點(diǎn)的取樣濃度,V1為各時間點(diǎn)固定取樣體積,V2為溶出介質(zhì)體積,m為溶出杯中指標(biāo)性成分B3的量。

        2.2 白頭翁總皂苷固體分散體制備工藝考察

        2.2.1 樣品制備 按處方分別稱取白頭翁總皂苷、EudragitS100,分別加入適量溶劑溶解后混勻,45℃減壓蒸發(fā)除去溶劑,真空干燥,粉碎過6號篩,即得。置干燥器內(nèi)備用。

        2.2.2 溶劑的考察 白頭翁總皂苷溶解性較差,為了使藥物和輔料達(dá)到分子水平的混合,必須將它們完全溶解后再混合。乙醇為制劑中常用的溶劑,對人體無害,對不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行考察。以將1 g藥物完全溶解所需最小體積的乙醇來考察藥物在50%、70%、90%乙醇中的溶解性。稱取適量白頭翁總皂苷于燒杯中,加入適量乙醇,攪拌,觀察是否溶解,若未完全溶解則繼續(xù)加入乙醇,直至完全溶解,記錄加入乙醇的量。結(jié)果1 g白頭翁總皂苷溶解所需50%、70%、90%乙醇的量分別為73、40、58 m L,顯示藥物在70%乙醇中溶解性最好。

        2.2.3 溶解溫度考察 考察白頭翁總皂苷在40℃、60℃、80℃在70%乙醇中的溶解性。結(jié)果顯示溫度對白頭翁總皂苷的影響較大,隨著溫度的升高溶解度提高。40、60、80℃時所需70%乙醇的量分別為79、47、40 mL。精密稱取適量白頭翁總皂苷于10 m L量瓶中,加入9 mL 70%乙醇,密封,平行3份。置于80℃水浴中分別于0、0.5、1、2 h取出,氮?dú)獯蹈扇軇┖?,加入甲醇超聲溶解,定容,混勻。過0.22μm微孔濾頭,取續(xù)濾液。按照 “2.1.2”色譜條件進(jìn)樣,計算指標(biāo)性成分常春藤皂苷元3-0-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄-(1→4)]-L-吡喃阿拉伯糖苷含有量。含量測定結(jié)果RSD為1.9%,表明在80℃水浴中白頭翁總皂苷在2 h內(nèi)穩(wěn)定性較好,因此選擇80℃為溶解溫度。

        2.2.4 載藥量考察 分別考察載藥量為10%、20%、30%時固體分散體體外累積釋放度。結(jié)果見表1,結(jié)果顯示隨著載藥量的提高,藥物在pH 6.80溶液中累計釋放度增加。載藥量30%時在人工小腸液中釋放較多,達(dá)到了20.9%。載藥量為20%時在人工小腸液中釋放較少,小于15%。因此確定載藥量為20%。體外溶出結(jié)果見表1。

        表1 白頭翁總皂苷固體分散體中指標(biāo)性成分 (B3)累積溶出度 (%,,n=6)Tab.1 Results of indicator com ponents(B3)in vitro release from total saponins from Pu lsatilla solid dispersion(%,,n=6)

        表1 白頭翁總皂苷固體分散體中指標(biāo)性成分 (B3)累積溶出度 (%,,n=6)Tab.1 Results of indicator com ponents(B3)in vitro release from total saponins from Pu lsatilla solid dispersion(%,,n=6)

        原料藥pH 1.0(2 h)釋放介質(zhì) 載藥量10% 載藥量20% 載藥量30% 0±0 0±0 0±0 2.1±0.19 pH 6.8(1 h) 8.2±0.32 9.4±0.44 15.3±0.31 80.7±3.6 pH 6.8(2 h) 9.5±0.41 10.3±0.36 17.5±0.45 80.2±4.3 pH 6.8(4 h)10.3±0.68 12.6±0.65 20.9±0.73 81.2±4.6 pH 7.8(2 h)86.6±0.68 86.2±1.8 88.1±1.2 81.0±3.7

        2.2.5 粉碎時間考察 取干燥的白頭翁總皂苷固體分散體于粉碎機(jī)中,粉碎一定時間,取出過6號篩。稱定質(zhì)量計算得率 [得率=(通過6號篩粉末的量/固體分散體總量) ×100%]。粉碎1、2、3、4、5 min時得率分別為 54.0%、83.8%、91.1%、95.5%、95.6%,結(jié)果顯示在4 min內(nèi)隨著時間的增加,得率增加,4 min時達(dá)到95.5%,4 min后繼續(xù)增加粉碎時間,得率基本不變。因此選擇將干燥的固體分散體粉碎4 min。

        根據(jù)以上單因素考察結(jié)果,確定采用Eudragit S100為輔料,載藥量為20%。EudrgitS100以乙醇溶解,備用,白頭翁總皂苷以70%乙醇水浴80℃加熱溶解,倒入EudragitS100溶液中混勻,45℃減壓蒸發(fā)除去溶劑,真空干燥,粉碎4 min過6號篩,既得。

        2.3 固體分散體的評價

        2.3.1 粒徑測定 馬爾文粒徑測定儀干法測定,樣品測定時間12 s,背景時間8 s,普通模式,遮光度0.5~6;分散進(jìn)樣控制:分散氣壓1.5 bar;進(jìn)樣速度60%;依上述條件建立測量程序SOP,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

        表2 粒徑分布(,n=3)Tab.2 Partical size in distribution(,n=3)

        表2 粒徑分布(,n=3)Tab.2 Partical size in distribution(,n=3)

        注:d(0.5)為中位粒徑,表示所測樣品中50%小于該值;d(0.9)為眾位粒徑表示所測樣品中90%小于該值。

        d(0.1)/μm d(0.5)/μm d(0.9)/μm 9.703±0.202 62.981±0.925 158.794±1.257

        2.3.2 電子掃描顯微鏡(SEM) 真空鍍金70 s,用掃描電鏡觀察白頭翁總皂苷、Eudragit S100,白頭翁總皂苷與EudragitS100的物理混合物及其固體分散體的表面結(jié)構(gòu),見圖1。Eudragit S100為球形

        或類球形顆粒,白頭翁總皂苷為卷曲的片狀,物理混合物中可見白頭翁總皂苷特征和Eudragit S100的特征,固體分散體為塊狀物,白頭翁總皂苷和Eudragit S100的特征均消失。

        圖1 Eudragit S100(A)、白頭翁總皂苷(B)、白頭翁總皂苷固體分散體 (C)、物理混合物 (D)的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of Eud ragit S100(A),total saponins from Pulsatilla(B),total saponins from Pulsatilla solid dispersion(C),and physical m ixture(D)

        2.2.3 傅利葉變換紅外光譜測定 采用KBr壓片法測定紅外光譜,分辨率4 cm-1,掃描范圍4 000~400 cm-1全譜掃描,結(jié)果見圖2。白頭翁總皂苷在782、815、882、914、1 387、1 695、2 941 cm-1存在特征吸收,Eudragit S100在752、842、1 388、1 449、1 729 cm-1存在特征吸收,固體分散體中白頭翁總皂苷的特征吸收峰782、815、882、2 941 cm-1消失,1 695 cm-1的特征吸收峰強(qiáng)度減弱。物理混合物的特征表現(xiàn)為白頭翁總皂苷和Eudragit S100特征峰的疊加。表明所制備的分散體并不是簡單的物理混合。

        3 工藝重復(fù)性

        按 “2.2”項(xiàng)確定的處方及方法制備3批白頭翁總皂苷固體分散體,按 “2.1.7”項(xiàng)下方法對其體外釋藥性能進(jìn)行評價,結(jié)果在pH 1.0的溶液中2 h累積溶出度均為0,在pH 6.8的溶液中4 h的累積溶出度分別為15.3%、15.0%、13.6%,在pH 7.8溶液中2 h累積溶出度分別為86.6%、 89.8%、87.0%。表明工藝重復(fù)性好。

        圖2 白頭翁總皂苷(A)、Eudragit S100(B)、白頭翁總皂苷固體分散體 (C)、物理混合物 (D)紅外光譜圖Fig.2 IR images of total saponins from Pulsatilla(A),Eudragit S100(B),total saponins from Pulsatilla solid dispersion(C),and physicalm ixture(D)

        4 討論

        結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)主要分為時滯型、酶控型、pH依賴型、壓力依賴型等,其中pH依賴型經(jīng)多年臨床研究證實(shí)具有結(jié)腸靶向制劑的治療特點(diǎn)和優(yōu)勢,是當(dāng)前開發(fā)結(jié)腸靶向制劑最有效的方法[8],目前已經(jīng)有pH依賴型、時滯型產(chǎn)品上市,如丹麥Ferring公司的Pentasa(時滯型)、英國Tillotts公司的Ascol(pH依賴型)[9]。制備方法上主要采用包衣/制備骨架片等方法。白頭翁總皂苷水溶性較差,直接將其制備成微丸,藥物難以釋放,陳振華等[10]將其制備成環(huán)糊精包合物后,其體外溶出明顯增加,環(huán)糊精的加入降低了微丸載藥量。中藥腸溶粉體、緩釋粉體已經(jīng)有較多報道[11-14],本實(shí)驗(yàn)以pH依賴型輔料EudragitS100為輔料,利用其pH大于7時才溶解的特性,采用溶劑法,制備白頭翁總皂苷固體分散體,使藥物在上消化道不釋放,達(dá)到結(jié)腸后再釋放,提高了藥物在結(jié)腸部位的濃度,以期達(dá)到提高白頭翁總皂苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效。電掃描鏡及紅外光譜分析結(jié)果均顯示制備的固體分散體并不是簡單的物理混合。當(dāng)載藥量為20%時,體外溶出度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在pH 6.8的溶液中累積溶出度較小,而在pH 7.8的溶液中釋放較快,達(dá)到了結(jié)腸定位效果。其體內(nèi)靶向性及在提高白頭翁總皂苷治療潰瘍性結(jié)腸炎療效方面將進(jìn)一步驗(yàn)證。

        由于白頭翁總皂苷固體分散體在pH 1.0、pH 6.8的溶液中難以溶出,因此在制備供試品時,采用的是物理混合物,并通過旋渦混合促進(jìn)藥物的溶出。固體分散體為多元分散體系,進(jìn)行溶出實(shí)驗(yàn)不

        容易更換溶液,因此分別取藥物在pH 1.0、pH 6.8、pH 7.8的溶液中考察其溶出度。

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        Preparation of colon-specific solid dispersion of total saponins from Pulsatilla

        TIAN Li1, LIU Hong-ning2, GUAN Yong-mei2, ZHU Wei-feng2, JIN Chen2, CHEN Li-hua2,YANG Ming1,2*

        (1.College of Pharmacy,Chengdu University of TCM,Chengdu 611137,China;2.Key Laboratory for Modern TCM Preparations,Ministry of Education;Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 33OOO4,China)

        AIM To prepare a colon-targeted solid dispersion of total saponins from Pulsatilla chinensis.

        total saponins from Pulsatilla chinensis;colon-specific;solid dispersion;in vitro release;scanning electron microscopy(SEM);Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)

        R944

        A

        1001-1528(2015)12-2619-05

        10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.010

        2015-04-27

        十二五重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目 (2013ZX09103002-001);江西省落地計劃項(xiàng)目 (贛財教 [2011]243號);江西省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(2012A036).

        田 力 (1987—),男 (土家族),碩士,從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel:13477985346,E-mail:461264789@qq.com

        *通信作者:楊 明,男,博士,教授,研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。Tel:(0791)87118658,E-mail:yangming16@126.com

        M ETHODS Total saponins from Pulsatilla solid dispersion prepared by solvents,took its in vitro cumulative release rate as the sole evaluation index for screening of optimal preparation and prescriptions analyzed by SEM and FTIR.RESULTS SEM and FTIR analysesmanifested that thewell-formed solid dispersion of total saponins from P.chinensis and Eudragit S100,when loaded with 20%drug,there was no in vitro release of indicator component in 2 h at pH 1.0;the 4h cumulative release rate was less than 16%when pH adjusted to 6.8;the 2 h cumulative release rate surpassed 86%at pH 7.8.CONCLUSION The prepared solid dispersion can be expected to be a colon-specific agent.

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