段 燁，高志強，王慧珊，張鶴曉，李 灝

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 朝陽 100029；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026；3.北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，北京 懷柔 101400）

核酸適體技術(shù)及其在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

段 燁1，高志強2，王慧珊3，張鶴曉2，李 灝1

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 朝陽 100029；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026；3.北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，北京 懷柔 101400）

近年來，隨著食品安全事件的頻繁發(fā)生，獸藥殘留已逐漸成為人們普遍關(guān)注的一個社會熱點問題。傳統(tǒng)的獸藥殘留檢測方法主要包括氣相色譜法、液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等，這些方法其具有檢測靈敏度較高、穩(wěn)定性較好等特點，但對樣品潔凈度的要求較高以及檢測成本較高，使得這幾種檢測方法無法滿足現(xiàn)場快檢的要求。因此，人們有必要開發(fā)更為簡單、快速、有效的獸藥殘留檢測方法。

核酸適體（aptamer），取自于拉丁文的“aptus”（意為適合）與希臘單詞“meros”，中文譯為“適體”、“適配子“或“核酸適體”[1]。適體的功能類似于抗體，適體-靶分子的結(jié)合與抗原-抗體的結(jié)合相似，同樣具有高度特異性，此外，適體還具有許多明顯優(yōu)于抗體的特性：（1）適體的靶分子范圍非常廣泛；（2）適體的親和力強、特異性高；（3）適體穩(wěn)定性好。

正是基于核酸適體的上述優(yōu)點，核酸適體技術(shù)在分析化學(xué)[2]、臨床[3]、食品安全[4]、分子識別[5]、藥物篩選[6]及藥物殘留檢測等方面都展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景。本文就核酸適體技術(shù)及其在獸藥殘留檢測分析中的應(yīng)用進(jìn)展及相關(guān)問題進(jìn)行綜述。

1 核酸適體技術(shù)及其研究進(jìn)展

核酸適體技術(shù)主要運用由Tuerk和Gold等人于1990年建立的指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential en?richment，SELEX），對體外人工合成的隨機寡核苷酸序列庫進(jìn)行反復(fù)篩選，從而獲得能以極高親和力和特異性與靶分子結(jié)合的一段寡核苷酸序列[7]。

1.1 SELEX技術(shù)原理及步驟 SELEX技術(shù)原理如圖1所示，通過重復(fù)篩選與擴增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或親和力較低的DNA或RNA分子被洗脫，而與靶物質(zhì)具有高親和力的DNA或RNA（適體）被從起初隨機文庫中分離出來，且其純度隨SELEX過程的進(jìn)行而增高，從pmol級到nmol級，最終占據(jù)庫的大多數(shù)（＞90%）。

1.2 核酸適體篩選中的分離方法 如何分離與

靶物質(zhì)結(jié)合的寡核苷酸分子是篩選過程的關(guān)鍵，但是在實際篩選中，SELEX技術(shù)往往受到篩選環(huán)境及技術(shù)本身限制，影響分離效果和篩選效率。近年來，研究人員在傳統(tǒng)SELEX基礎(chǔ)上，發(fā)展出許多不同的篩選分離方法。

圖1 SELEX流程

1.2.1 硝酸纖維素膜（Nitrocellulose filtermembrane，NC）過濾法 硝酸纖維素膜過濾法利用NC膜能吸附蛋白而不吸附游離DNA的特性，將共孵育的混合物經(jīng)NC膜用真空抽吸過濾，與靶分子結(jié)合的寡核苷酸分子滯留在濾膜上，而未結(jié)合靶分子的游離寡核苷酸分子則被濾除掉。經(jīng)洗滌、剪碎濾膜，利用洗脫、乙醇沉淀等回收與NC膜結(jié)合的寡核苷酸分子。劉曉靜[8]于2004年用硝酸纖維素膜過濾法篩選到了人TGF-βRII核酸適體。該法操作簡單、成本低，無需特殊設(shè)備；但此法不能應(yīng)用于較小的靶分子，且對具有豐富構(gòu)象的隨機寡核苷酸序列有較強的背景吸附。

1.2.2 親和柱法 親和柱法是將靶分子通過共價鍵或親和力連接到凝膠樹脂上，將隨機單鏈寡核苷酸庫灌注層析柱，其與靶分子在層析柱上作用一定時間后，用沖洗緩沖液進(jìn)行沖洗，與靶物質(zhì)結(jié)合的文庫序列會滯留在樹脂上，未結(jié)合序列則流出層析柱，最后加入洗脫液洗脫下結(jié)合序列，即可獲得相應(yīng)的核酸適體。該法操作簡便，能適用于小分子靶物質(zhì)的核酸適體篩選。

2008年秦川[9]把青霉素與Epoxy（環(huán)氧基）活化瓊脂糖凝膠FF偶聯(lián)做固定相，通過親和柱層析SELEX篩選方法，篩選獲得青霉素的核酸適體。

1.2.3 磁珠法 磁珠可作為固相載體用于SELEX篩選，該法不僅可改善傳統(tǒng)硝酸纖維素膜過濾法和親和柱法相對費時費力、效率低下等問題，還可用于分離和建立所篩選的次級文庫。1997年，Bruno等人[10]率先將甲苯磺酰基活化的磁珠作為固相載體連接靶蛋白，利用SELEX技術(shù)篩選核酸適體，他們將PCR引物進(jìn)行生物素標(biāo)記，經(jīng)PCR擴增后核酸適體會被生物素標(biāo)記，加入固定在磁珠上的靶蛋白及鏈親和素就可檢測每輪篩選文庫與靶蛋白的結(jié)合力。

1.2.4 聚丙烯微孔板法 聚丙烯微孔板法是將靶分子固定在微孔板上，用牛血清封閉其余的位點，然后加入隨機寡核苷酸文庫，共孵育之后通過簡單洗滌即可除去未結(jié)合的寡核苷酸序列，最后洗脫回收結(jié)合的寡核苷酸序列。2007年，馮香玲[11]將DON（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）人工抗原吸附在微孔板上，以其作為固定相，經(jīng)過10輪的篩選和擴增，得到了DON特異性的核酸適體。該法操作簡單，成本低；但篩選效率較低。

1.2.5 毛細(xì)管電泳（Capillary electrophoresis，CE）法

毛細(xì)管電泳法基于結(jié)合靶分子的寡核苷酸分子電泳遷移速度變緩的原理，進(jìn)行核酸適體的篩選分離。

2004年，Mendonsa等人[12]利用毛細(xì)管電泳成功分離獲得免疫球蛋白IgE的核酸適體。CE-SELEX的出現(xiàn)極大提高了篩選效率和靶蛋白的適體親和力，僅需2-4輪篩選就可獲得靶分子高親和力的ssDNA特異適體。但該法也存在諸如分離量小、不同靶分子的電泳條件需要各自優(yōu)化等缺點，對不能引起較高電泳遷移率的靶分子如一些小分子、細(xì)胞等的分離效率低下；此外毛細(xì)管電泳儀的低普及程度也限制了CE-SELEX技術(shù)應(yīng)用和推廣。

以上這5種分離方法都有它們的優(yōu)缺點，因此，要根據(jù)靶分子的性質(zhì)特性以及獲得的核酸適體的用途來選擇何種分離方法。

2 核酸適體技術(shù)在獸藥殘留檢測分析中的應(yīng)用

獸藥在預(yù)防和治療動物疾病，特別是細(xì)菌病、寄生蟲病方面極其重要，有些獸藥作為飼料添加劑在促進(jìn)動物生長。獸藥的長期過度使用導(dǎo)致了獸藥殘留。獸藥殘留（Residues ofveterinary drug）是指動物用藥后，任何可食動物源性產(chǎn)品中所含有的原型藥物或/和其代謝產(chǎn)物，以及與獸藥有關(guān)雜質(zhì)的殘留[13]。殘留在動物體內(nèi)的獸藥，可隨食物鏈進(jìn)入人體，對人類健康構(gòu)成潛在威脅。核酸適體技術(shù)具有高特異性及靈敏度，可較好地進(jìn)行獸藥殘留檢測。

2.1 核酸適體技術(shù)在抗生素類藥物檢測分析中的應(yīng)用 為有效預(yù)防和治療畜禽疾病，抗生素類藥品和飼料被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖，然而抗生素濫用，對環(huán)境安全及人類健康均造成極大威脅。因此，針對抗生素殘留超標(biāo)的檢測不容忽視。

由于大部分抗生素都是半抗原，用免疫反應(yīng)獲得其抗體比較困難，但核酸適體技術(shù)的出現(xiàn)為抗生素殘留的檢測提供了新思路，即以抗生素作為靶物質(zhì)通過體外篩選其核酸適體，進(jìn)而用于檢測分析。近年來，已有多種抗生素的核酸適體被篩選獲得并在檢測中得以應(yīng)用（表1）。Wochner等人[21]則將所篩選出的柔紅霉素的核酸適體固定于金納米顆粒，構(gòu)建了一種電化學(xué)傳感器，用于檢測人尿液中該藥物的殘留。2009年，Lee等人[22]將他們所篩選的土霉素的核酸適體作為分子識別元件，利用電化學(xué)生物傳感器對土霉素進(jìn)行檢測，檢測線范圍為1～100 nmol/L。

表1 部分抗生素核酸適體

2.2 核酸適體技術(shù)在磺胺類藥物以及驅(qū)蟲劑類藥物檢測分析中的應(yīng)用 磺胺類藥物為廣譜抗菌藥，對許多革蘭陽性菌和陰性菌均有效。在近15-20年，動物源食品中磺胺類藥物殘留量超標(biāo)現(xiàn)象十分嚴(yán)重，所以對其檢測迫在眉睫。2013年，倪姮佳[23]利用SELEX技術(shù)，經(jīng)過9輪篩選成功獲得磺胺甲基嘧啶的核酸適體，其篩選率約為75%；并建立了基于磺胺甲基嘧啶核酸適體的直接競爭化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。其檢測限為0.92 nmol/mL，IC50為5.61 ng/mL，線性范圍為1.85～21.57 ng/mL。該方法可成功檢測牛奶中磺胺甲基嘧啶殘留，其回收率為88.0%～98.2%，變異系數(shù)為10.0%～23.4%。

驅(qū)蟲劑類以有機磷類化合物應(yīng)用最廣泛，可有效殺滅生物機體內(nèi)外的寄生蟲。近幾年來，核酸適體技術(shù)在驅(qū)蟲劑檢測分析中的應(yīng)用正在興起。例如，王麗等人[24]于2013年利用核酸適體技術(shù)，從一個固定的隨機ssDNA庫中對甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果等4種有機磷農(nóng)藥的DNA適體進(jìn)行了同時篩選并建立了檢測方法。

2.3 核酸適體技術(shù)在激素與其他生長促進(jìn)劑類檢測分析中的應(yīng)用 在畜牧生產(chǎn)過程中，為加快畜禽增長及出欄率，過量激素或生長素經(jīng)常被人為添加。當(dāng)人食用這些含大量激素的肉類食品后，也會導(dǎo)致相應(yīng)疾病的發(fā)生，甚至導(dǎo)致死亡。因此，很有必要加大對食品中這些物質(zhì)的檢測、監(jiān)管力度。為了更快捷、方便的檢測，科研工作者篩選獲得了多種激素的核酸適體（表2）。Kim等人[25]將17-β雌二醇的核酸適體與電極相連，利用電化學(xué)生物傳感器對17-β雌二醇進(jìn)行檢測。

2.4 核酸適體技術(shù)在其他非法添加物檢測分析中的應(yīng)用 孔雀石綠曾被許多國家廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的殺蟲劑和殺菌劑，用以殺滅體外寄生蟲和魚卵中的真菌。由于孔雀石綠在魚體內(nèi)和環(huán)境中殘留時間長，并具有潛在致突變、致畸和致癌的危險性，故我國、美國、加拿大以及歐盟等許多國家均禁止將其作為獸藥用于人類食用魚。2001年，Grate等人[28]利用RNA適體對孔雀石綠進(jìn)行檢測，檢出限可達(dá)到1μmol/L，從此該核酸適體被作為識別元素用于魚肉組織內(nèi)的孔雀石綠的熒光檢測。

表2 部分激素核酸適體

此外，各種汞制劑如氯化亞汞、硝酸亞汞、乙酸汞、吡定基乙酸汞，曾被作為有效的殺蟲劑而用于動物殺蟲，但因其劇毒性，現(xiàn)已被禁止作為獸藥繼續(xù)使用。2009年，Xu等人[29]設(shè)計了6條長

度為20個核苷酸且富含T堿基的DNA序列，利用非修飾的納米金建立了基于納米金顏色變化的Hg+檢測方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有4個T-T堿基對序列的檢測效果最好，檢出限可達(dá)0.51μmol/L。

3 展望

核酸適體技術(shù)自問世以來，在篩選技術(shù)上不斷豐富和完善，應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展。通過篩選獲得的核酸適體已被廣泛用于激素類、殺菌劑、抗生素、驅(qū)蟲劑等獸藥殘留的檢測，其檢出限已經(jīng)超過了傳統(tǒng)檢測方法，其檢測靈敏度可完全達(dá)到相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。

與其他傳統(tǒng)的檢測方法如色譜法、酶標(biāo)法相比，基于核酸適體的檢測方法有很強的發(fā)展?jié)摿?，具有操作簡單，耗時短，靈敏度高，成本低廉，且易于現(xiàn)場檢測等特點，非常適用于獸藥殘留的現(xiàn)場快速檢測和風(fēng)險預(yù)警。但是核酸適體技術(shù)在獸藥殘留檢測分析領(lǐng)域依舊面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，例如，相比于種類繁多的抗體，針對不同獸藥的核酸適體的種類是有限的，這也是制約核酸適體用于獸藥殘留檢測發(fā)展的主要瓶頸。

此外，傳統(tǒng)SELEX技術(shù)以小分子為靶分子進(jìn)行篩選時，通常把靶分子固定在凝膠或者磁珠上，來實現(xiàn)分離過程。但是類似獸藥等小分子，直接固定在基質(zhì)上有一定難度，需要在小分子上引入活性基團(tuán)使其與固相載體結(jié)合。而獸藥靶分子的改造需要保證其活性不被破壞，且不能掩蓋與核酸的結(jié)合位點。因此，如何既能固定靶分子，又能保證靶分子的活性以及其結(jié)合位點不被阻斷，將是未來的重要研究方向。

總之，隨著核酸適體技術(shù)的不斷進(jìn)步，其在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用也將更為廣泛和深入，必將促進(jìn)獸藥殘留檢測的發(fā)展。

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S852.65

A

0529-6005（2015）11-0075-03

2014-12-05

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201310253）

段燁（1988-），女，碩士生，主要從事生物工程研究，E-mail：duanziling@foxmail.com

李灝，E-mail：lihao@mail.buct.edu.cn