向王震，肖 進(jìn)，，王璐瑤，李 靜，巴利民，齊 鵬，汪 明，

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100095；2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研究院，北京 海淀 100070）

牛主要組織相容性復(fù)合物BoLA基因研究進(jìn)展

向王震1，肖 進(jìn)1，2，王璐瑤1，李 靜1，巴利民2，齊 鵬2，汪 明1，2

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100095；2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研究院，北京 海淀 100070）

牛主要組織相容性復(fù)合體MHC（BoLA）與移植排斥反應(yīng)和免疫反應(yīng)密切相關(guān)，是免疫學(xué)研究的重要內(nèi)容。本文簡述了牛BoLA分布、結(jié)構(gòu)及其功能，介紹BoLA與疾病易感性，免疫應(yīng)答調(diào)控之間的關(guān)系及表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)方面的研究。

1 簡介

主要組織相容性復(fù)合物（major histocompati?bility complex，MHC）是動(dòng)物體內(nèi)由緊密連鎖、高度多態(tài)的基因座位所組成的一個(gè)基因家族。MHC基因產(chǎn)物稱為MHC抗原，是一類存在于細(xì)胞表面的糖蛋白，主要負(fù)責(zé)連接和遞呈抗原性多肽給T淋巴細(xì)胞。因此對(duì)MHC基因表達(dá)的分析是免疫應(yīng)答與調(diào)控相關(guān)研究的重要內(nèi)容。

2 BoLA基因及其表達(dá)產(chǎn)物

Amorena B.[1]等（1978）首次報(bào)道牛的MHC I類抗原，并將牛MHC系統(tǒng)命名為牛白細(xì)胞抗原系統(tǒng)（bovine leucocyteantigen，BoLA）。此后，Letesson等發(fā)現(xiàn)BoLAⅡ類抗原。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，大量分子生物學(xué)技術(shù)手段被運(yùn)用來進(jìn)行BoLA基因的研究。

BOLA基因位于牛的第23號(hào)染色體[2]，主要分為BoLA-Ⅰ類，BoLA-Ⅱ類，BoLA-Ⅲ類基因。Bo?LA-Ⅰ類區(qū)域包含約1 550 kb大小基因片段，且該區(qū)域有兩個(gè)緊密聯(lián)系的基因表達(dá)座位BoLA-A和BoLA-B[3]。BoLA-Ⅰ類分子幾乎分布于所有有核細(xì)胞表面。大多數(shù)組織和細(xì)胞都具有較高濃度的BoLA-Ⅰ類分子分布，其中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞濃度最高。BoLA-Ⅰ類抗原由一條α鏈和一條β鏈非共價(jià)鍵結(jié)合而成。α鏈為重鏈，分子量為44 kDa，含346個(gè)氨基酸殘基，由α1功能區(qū)、α2功能區(qū)、α3功能區(qū)、跨膜區(qū)和胞區(qū)質(zhì)組成。β鏈為輕鏈，分子量為12 kDa，游離于細(xì)胞膜外通過非共價(jià)鍵與α鏈結(jié)合。BoLA-Ⅰ類分子的主要功能是進(jìn)行內(nèi)源性抗原的呈遞。BoLA-Ⅰ類分子的溝槽可與細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶體加工過的內(nèi)源性抗原以氫鍵結(jié)合，并將其呈遞給T細(xì)胞，引發(fā)免疫反應(yīng)。BoLA-Ⅰ類分子結(jié)合的多肽一般為8-11個(gè)氨基酸。

BoLA-Ⅱ類基因靠近牛23號(hào)染色體的著絲點(diǎn)。Ⅱ類基因分為兩個(gè)亞區(qū)-Ⅱa和Ⅱb。Ⅱa包括DR基因和DQ基因。DR基因含DRA、DRB1、DRB2和DRB3四個(gè)基因座位，DQ基因至少含有DQA1、DQA2、DQB1和DQB2等四個(gè)基因座位；Ⅱb區(qū)域包括DMA，DMB，LMP2，LMP7和TAP等基因，它們參與抗原遞呈和傳輸?shù)倪^程。其他基因DNA，DOB，DIB，DYA和DYB，目前具體功能還不明確[4]。BoLA-Ⅱ類基因的編碼產(chǎn)物稱為BoLA-Ⅱ類分子。BoLA-Ⅱ類分子是由一條重鏈（α鏈）和一條輕鏈（β鏈）以非共價(jià)鍵結(jié)合而成的復(fù)合物。這兩條鏈都是跨膜結(jié)構(gòu)，α鏈和β鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似，只是α鏈稍大于β鏈，其分子量分別為33 kDa和28 kDa。X-衍射晶體結(jié)構(gòu)分析表明α鏈和β鏈在細(xì)胞外分別含有兩個(gè)功能區(qū)α1、α2，和β1、β2，每個(gè)功能區(qū)分別由約90個(gè)氨基酸殘基組成。BoLA-Ⅱ類分子的主要作用是遞呈外源性抗原多肽，其遞呈抗原肽長度大約為12～18個(gè)氨基酸殘基，最長可達(dá)28個(gè)[5-6]。

BoLA-Ⅲ類基因由一組不同種類的基因構(gòu)成，這些基因與免疫功能相關(guān)，負(fù)責(zé)編碼補(bǔ)體成分B因子和C4，類固醇21-羥化酶，熱休克蛋白70以及腫瘤壞死因子α和β。目前對(duì)于BoLA-Ⅲ類基因及其表達(dá)產(chǎn)物的研究較少[4]。

3 BOLAⅡ類a亞區(qū)DR基因

DR基因含DRA、DRB1、DRB2和DRB3四個(gè)基因座位。DRA基因編碼DR分子的α鏈，BoLA-DRA由于只有一個(gè)等位基因被報(bào)道，所以一直以來被認(rèn)為是單形態(tài)。然而，近期的一些研究表明，牛

的DRA座位出現(xiàn)了等位變異。相比之下，編碼DR分子β鏈的DRB基因具有高度多態(tài)性。多態(tài)性主要集中在編碼多肽結(jié)合位點(diǎn)可變部分的第二外顯子。牛有至少3個(gè)DRB基因座位，但僅僅BoLADRB3基因是有功能的。BoLA-DRB1是假基因，在β1和橫跨膜區(qū)域攜帶終止密碼子，其基本不具多態(tài)性。BoLA-DRB2在所有基因表達(dá)時(shí)表達(dá)水平很低，不具備多態(tài)性[7]。

3.1 牛DRB3基因座位的多態(tài)性 目前研究多集中在BoLA-DRB3基因多態(tài)性方面。大量研究報(bào)道了在DRB3的第二外顯子位點(diǎn)存在高度多態(tài)性，并且不同品種牛該位點(diǎn)等位基因的頻率各不相同（表1）[6]。

DRB3基因座位的多態(tài)性研究具有重要意義，因?yàn)檫@個(gè)區(qū)域存在著抗原遞呈位點(diǎn)并且該區(qū)域的多態(tài)性可能與不同個(gè)體面對(duì)特殊病原時(shí)激發(fā)不同水平免疫應(yīng)答有關(guān)。很多研究報(bào)道了某一個(gè)或多個(gè)BoLA-DRB3.2等位基因與機(jī)體對(duì)某些傳染病的抗病性的關(guān)系（表2）[6]。

表1 不同牛品種DRB3.2基因座位上頻率高于0.05的等位基因

3.2 DRB3.2基因座位的多樣性和疫苗接種 觀察BoLA-Ⅱ類DRB3基因座位等位基因的多樣性是否影響不同個(gè)體在疫苗接種后保護(hù)力的相關(guān)研究已經(jīng)開展。Ballingal K T[8]等報(bào)道，在與子孢子P67抗原發(fā)生免疫反應(yīng)之后，BoLA-Ⅱ型DRB3*2703和DRB3* 1501等位基因和面對(duì)小泰勒蟲威脅時(shí)的保護(hù)力水平相關(guān)。Baxter[9]等報(bào)道，BoLA-DR分子肽結(jié)合口袋對(duì)于?？谔阋吆铣呻囊呙缭O(shè)計(jì)意義重大。研究表明，BoLA-DRB3等位基因的結(jié)合口袋與針對(duì)口蹄疫病毒VP1基因表達(dá)的四十肽的免疫應(yīng)答相關(guān)。位于DR分子多肽結(jié)合區(qū)域不同位點(diǎn)的幾個(gè)氨基酸和抗體應(yīng)答水平重要相關(guān)。進(jìn)一步的分析表明，結(jié)合口袋的特殊殘基對(duì)于疫苗設(shè)計(jì)至關(guān)重要。

3.3 MHCⅡ類分子的多肽結(jié)合位點(diǎn) Srinivasan M[10]等證明，每個(gè)抗原遞呈細(xì)胞結(jié)合加工抗原的MHCⅡ類受體分子數(shù)目很少，并且這個(gè)量足以激活T淋巴細(xì)胞。另外，Chicz RM[11]等報(bào)道，利用高效液相色譜，質(zhì)譜法和微測序分析法對(duì)酸洗脫的肽段與HLA-DR1結(jié)合的特點(diǎn)進(jìn)行研究。多肽相對(duì)分子質(zhì)量在1 602到2 996之間（13～25個(gè)殘基）。Mouritsen S[12]等利用等電子聚焦分離MHCⅡ類分子和其結(jié)合的自身多肽來研究MHCⅡ類分子與肽段結(jié)合的特點(diǎn)。他們觀察到從某一種等位基因形態(tài)的MHCⅡ類分子上洗脫下來的肽段能夠與相同等位基因形態(tài)的MHCⅡ類分子結(jié)合，而不能與不同等位基因形態(tài)的MHCⅡ類分子結(jié)合。

表2 在不同品種牛中不同疾病和BOLA-DRB3.2等位基因的關(guān)系

有關(guān)肽段與MHCⅡ類分子結(jié)合特點(diǎn)的研究具有重要意義，這將有助于我們更好的明白這種結(jié)合的方式，對(duì)于構(gòu)想設(shè)計(jì)疫苗來提高動(dòng)物機(jī)體面對(duì)傳染病威脅時(shí)的保護(hù)力至關(guān)重要。

4 BoLA表達(dá)蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

2010年，第一個(gè)BOLA I類分子N*01301與泰勒原蟲免疫優(yōu)勢表位的結(jié)構(gòu)被解析出來。對(duì)其遞呈的優(yōu)勢表位構(gòu)象的分析揭示了該MHC I類表型易引發(fā)強(qiáng)有效免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。值得注意的是，BoLA等位基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析目前在國內(nèi)研究得較少。2011年，夏春[13]等利用X射線衍射技術(shù)，解析了BoLAⅠ類N*01801基因表達(dá)蛋白與牛瘟病毒來源的抗原肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并且分析了遞呈的抗原肽兩種不同的構(gòu)象。他們發(fā)現(xiàn)第73位異亮氨酸是靈活可變的，允許MHC分子凹槽適應(yīng)不同的構(gòu)象來容納牛瘟病毒來源的抗原肽。這種宿主遞呈抗原的方式有利于創(chuàng)造出一個(gè)更為豐富的T細(xì)胞受體庫，這對(duì)于產(chǎn)生更為有效的細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫應(yīng)答意義重大。2014年，夏春[14]等又解析了牛CD8αα分子同遞呈口蹄疫病毒來源肽段FMDV-VP1YY9的BoLA-2*02201 I類分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。國外有學(xué)者認(rèn)為，與BoLA分子結(jié)合的抗原肽氨基酸殘基替換后能夠?qū)е碌任换虻鞍妆磉_(dá)產(chǎn)物獨(dú)特空間構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而影響免疫應(yīng)答過程中保護(hù)性抗體的表達(dá)量[15]。這對(duì)設(shè)計(jì)合成肽疫苗激發(fā)更為有效免疫應(yīng)答有著重要啟示意義。目前，已報(bào)道有3個(gè)BoLAⅠ類相關(guān)分子結(jié)構(gòu)被解析，而還沒有BoLA II類分子結(jié)構(gòu)被解析出來的相關(guān)報(bào)道。

5 展望

MHC分子在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。Ⅱ類分子廣泛的結(jié)構(gòu)多態(tài)性是造成同一種群中不同個(gè)體針對(duì)傳染性病原體產(chǎn)生不同免疫應(yīng)答的原因。而DRB3基因的第二外顯子的高度多態(tài)性可能有助于鑒別抗病性強(qiáng)的單倍型。對(duì)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的研究也有助于開發(fā)和設(shè)計(jì)含有病原體的一種或多種T細(xì)胞表位的合成肽疫苗。這將給動(dòng)物機(jī)體提供更好的保護(hù)力，給未來傳染病防控提供更為有效的措施。

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S823

A

0529-6005（2015）11-0072-03

2014-10-20

向王震（1990-），男，碩士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：13141319644@163.com

汪明，E-mail：vetdean@cau.edu.cn