趙成堅，黃 勇，谷穎樂，徐永莉，張月云，李 力

（廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023）

蛤蚧銅綠色假單胞菌與弗氏檸檬酸桿菌混合感染的分離鑒定與藥敏試驗

趙成堅，黃 勇，谷穎樂，徐永莉，張月云，李 力

（廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023）

從瀕死蛤蚧的肝臟、腎臟分離出2株革蘭陰性桿菌（L1，L2），對分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性、生化特性和分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)行動物毒性試驗。結(jié)果顯示，2株細(xì)菌基因組DNA均可擴增得到大小為1 450 bp的特異性片段，該序列與GenBank上已經(jīng)登錄的銅綠色假單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌序列同源性分別達(dá)到99%和98%。結(jié)合以上幾種鑒定方法最終確定L1，L2為銅綠色假單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌。動物毒性試驗證明，其對小鼠有較強的致病性。體外藥敏試驗表明，銅綠色假單胞菌對頭孢他啶、環(huán)丙沙星、諾氟沙星高度敏感；弗氏檸檬酸桿菌對頭孢噻肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、丁胺卡那霉素高度敏感。

蛤蚧；銅綠色假單胞菌；弗氏檸檬酸桿菌；藥敏試驗

蛤蚧（Gekko gecko）是主產(chǎn)廣西的珍稀動物藥材，具有補肺益腎，納氣定喘，助陽益精之功效。主要用于治療虛勞喘咳、陽痿、神經(jīng)衰弱和小兒疳積等疾病[1]。近年來，隨著以蛤蚧為主要原料的各種藥品不斷開發(fā)，市場對蛤蚧需求量呈上升趨勢。由于棲息地破壞和對野生蛤蚧采取滅絕性的捕捉，現(xiàn)有的野生蛤蚧資源已難以滿足市場的需求，人工養(yǎng)殖蛤蚧勢在必行[2]。在人工養(yǎng)殖過程中，由于飼養(yǎng)密度增大，飼料品種單一，營養(yǎng)不均衡，缺乏必要的陽光照射等，容易發(fā)生諸如口腔炎（見中插彩版圖1），軟骨?。ㄒ娭胁宀拾鎴D2），腳趾膿腫[3]等一系列疾病的發(fā)生，尤其是細(xì)菌性疾病對蛤蚧人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的危害。本研究通過對養(yǎng)殖基地具有典型癥狀的發(fā)病蛤蚧進(jìn)行實驗室檢查，首次從其肝臟和腎臟中分離出銅綠色假單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌，利用16S rDNA對分離菌進(jìn)行分子鑒定。通過動物接種試驗測定其致病力，再通過藥敏試驗分析菌株對各類抗生素的敏感性，以期為蛤蚧的疾病防治提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及實驗動物來源 采集廣西藥用植物園蛤蚧養(yǎng)殖基地具有典型癥狀蛤蚧的肝臟、腎臟。小鼠，體重18～20 g，購自廣西中醫(yī)藥研究院實驗動物中心。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基參照姚火春[4]的方法進(jìn)行配制。革蘭染色試劑盒；常規(guī)細(xì)菌微量生化鑒定管；EZUP柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；16S rDNA引物（27F、1492R），超純水，Taq DNA聚合

酶，dNTP，10×Taq Buffer緩沖液，分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2 000；頭孢噻肟（30μg）、頭孢唑林（30μg)、頭孢噻吩（30μg）、氨芐西林（10μg）、環(huán)丙沙星（5μg）、諾氟沙星（10μg）、丁胺卡那霉素（30μg）、新霉素（30μg）、鏈霉素（10μg）、復(fù)方新諾明（25μg）共10種，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 病理剖檢觀察 對發(fā)病瀕死蛤蚧進(jìn)行剖檢，記錄眼觀病理變化。無菌操作采取有典型病理變化的肝臟，腎臟。

1.4 菌株的分離與純化、染色鏡檢 用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌的分離。取肝臟、腎臟直接在普通營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離30℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。從優(yōu)勢菌落中分別選取單菌落，繼續(xù)純化培養(yǎng)24 h。從肝臟分離的菌株暫命名為L1,從腎臟分離的菌株命名為L2。將這兩個菌株分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫條件下培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行涂片，革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.5 生理生化鑒定 細(xì)菌的生化鑒定參照姚火春[4]等的方法進(jìn)行。挑取純化分離的菌落到微量生化反應(yīng)管中，觀察結(jié)果。

1.6 純化培養(yǎng)后細(xì)菌DNA的抽提 細(xì)菌DNA的抽提參照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.7 分離菌的16S rDNA擴增 將收集的DNA溶液在PCR儀上擴增。PCR擴增體系為50μL，其中包括dNTP（2.5 mmol/L）4μL，10×Taq Buffer 5 μL，引物27F和1492R各2μL，Taq酶0.3μL，模板DNA 2μL，超純水34.7μL。反應(yīng)的程序為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s；52℃退火1 min，72℃延伸90 s；35個循環(huán)；72℃延伸10 min。增加一個對照，其他擴增條件相同，沒有增加菌株。將擴增的產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠呈像系統(tǒng)觀察并保存。純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序序列在GenBank中Blast比對，選取相關(guān)序列，利用分子生物學(xué)軟件分析同源性。

1.8 動物接種試驗 將分離純化的菌株制成懸液，取體重18～20 g小鼠30只，分為3組，每組10只。試驗組分別腹腔注射0.5mL/只，濃度為（9× 108CFU/mL）的細(xì)菌懸液；對照組小鼠腹腔注射同劑量的滅菌生理鹽水。觀察小鼠的發(fā)病狀況和死亡情況，采內(nèi)臟實質(zhì)器官作涂片鏡檢和接種培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，依據(jù)上述方法進(jìn)行菌種鑒定。

1.9 藥敏試驗 取2株分離菌株進(jìn)行藥敏試驗，具體操作步驟參照藥敏試紙使用說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢觀察 肝臟質(zhì)地較硬，有白色的結(jié)節(jié)分布（見中插彩版圖3），腎臟腫大，有出血點（見中插彩版圖4）。

2.2 菌株的分離培養(yǎng)及染色鏡檢 兩菌株在顯微鏡下的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性如表1所示。

表1 菌株的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性

2.3 生理生化測定 L1菌株能分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不分解麥芽糖、乳糖。甲基紅試驗、吲哚試驗、V-P試驗陰性。L2菌株氧化酶試驗、V-P試驗、吲哚試驗陰性、不分解麥芽糖，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。如表2所示。

表2 L1、L2菌株的生理生化性狀

2.4 16S rDNA序列分析 凝膠電泳結(jié)果顯示，L1菌株與L2菌株均可擴增出約1 450 bp片段（圖5）。將這兩株菌的16S rDNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行核酸同源性檢索。L1與GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的銅綠色假單胞菌（登錄號FJ972535.1）序列相似度為99%。L2與GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的弗氏檸檬酸桿菌（登錄號AF025365.1）序列相似度為98%。結(jié)果表明，L1為銅綠色假單胞菌，L2為弗氏檸檬酸桿菌。

2.5 動物接種試驗結(jié)果 接種菌液的小鼠于接種后12 h發(fā)病，病鼠表現(xiàn)精神沉郁，蜷臥不動，聚堆寒顫。18 h后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，對照組無發(fā)病或死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟腫脹、淤血，并有多個灰白色壞死灶；腎臟腫大、變脆，取內(nèi)臟器官按上述方法進(jìn)行無菌

分離菌種，并用理化方法和16S rDNA PCR法鑒定，結(jié)果與病料中分離到的兩株菌一致。

圖5 16S rDNAPCR結(jié)果M：DL-2 000；L1、L2：菌株16S rDNA產(chǎn)物；C：對照

2.6 藥敏試驗結(jié)果 利用涂布法對L1，L2菌株進(jìn)行常用藥物的敏感性測定，試驗判定結(jié)果表明，L1菌株對頭孢他啶、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感；其他藥物均表現(xiàn)為耐藥。L2菌株對頭孢唑林、復(fù)方新諾明、鏈霉素中介，氨芐西林、新霉素耐藥，其他藥物均表現(xiàn)敏感。見表3。

表3 菌株的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

銅綠色假單胞菌感染后因膿汁和滲出液等病料呈綠色，故又稱為綠膿桿菌，廣泛存在于自然界、人和動物的皮膚、呼吸道、腸道等。在正常情況下，對動物和人體基本無毒或弱毒，但出現(xiàn)移位寄居、菌群失調(diào)或宿主防御機能降低時，常可引起嚴(yán)重感染[5]。近年來，陸續(xù)有報道從病死的猛禽[6]、雛雞、雛鴨等禽類、水貂[7]、大熊貓[8]、小尾寒羊[9]。甚至是昆蟲大麥蟲[10]分離到此菌，且具有致病力。張月云[3]等，利用高錳酸鉀與復(fù)方新諾明等治愈了蛤蚧因感染銅綠色假單胞菌而引起的口腔炎。而本研究的藥敏試驗表明，此菌株對包括復(fù)方新諾明、丁胺卡那霉素等多種抗生素表現(xiàn)出耐藥性。經(jīng)調(diào)查，在蛤蚧養(yǎng)殖過程中喂食了人工養(yǎng)殖的黃粉蟲，大麥蟲等，并未使用過抗生素，說明耐藥菌株的存在與耐藥基因的遺傳和轉(zhuǎn)移有關(guān)，由于銅綠色假單胞菌固有的特性，表現(xiàn)出對內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素、喹諾酮類、四環(huán)素類和磺胺類藥物等表現(xiàn)出存在天然或者獲得性多重耐藥，使得用藥起來十分困難。

弗氏檸檬酸桿菌隸屬腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬，廣泛分布于自然界中，是哺乳類、鳥類、爬行類及兩棲類動物腸道內(nèi)正常的菌群，為條件致病菌。國內(nèi)外關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動物患病死亡的病例已有報道，李華等[11]首次報道弗氏檸檬酸桿菌可引起河蟹感染敗血癥，病蟹鰓組織大面積腫脹、壞死。舒新華等[12]報道了養(yǎng)殖烏鱧感染弗氏檸檬酸桿菌后引發(fā)了腹水病，病魚主要表現(xiàn)突眼，豎鱗，皮下積水，肛門紅腫，肝脾腎腫大等癥狀。沈錦玉等[13]報道紅螯螯蝦感染該菌后，蝦尾部肉質(zhì)樣腫脹或潰爛，肝胰腺棕黃色。

本試驗首次發(fā)現(xiàn)了蛤蚧混合感染銅綠色假單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌，并均有較強的致病性，嚴(yán)重侵害蛤蚧的肝臟及腎臟，最終導(dǎo)致死亡。在藥物的選擇上，使用頭孢他啶、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等將取得最佳的治療效果。

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R 378.91

B

0529-6005（2015）11-0052-03

2014-05-27

廣西科技廳項目（桂科重12118005-2-5）；南寧市科技攻關(guān)項目（20123238）

趙成堅（1979-），男（壯族），助理研究員，碩士，從事藥用動物養(yǎng)殖及疾病防治研究，E-mail：yournut@126.com

李力，E-mail：liboshi1963@vip.163.com