王麒文，張鶴曉，高志強(qiáng)，林祥超，張樂萃

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽 100026）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的原核表達(dá)和間接ELISA方法的建立

王麒文1，張鶴曉2，高志強(qiáng)2，林祥超1，張樂萃1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽 100026）

根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒JX株編碼N蛋白的ORF7基因序列設(shè)計(jì)特異性引物。采用RT-PCR方法擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7基因片段（367 bp），將其克隆于表達(dá)載體pET-32a上。測(cè)序驗(yàn)證后將重組質(zhì)粒pET-32a-JX-N轉(zhuǎn)入宿主菌Rosetta，經(jīng)0.7mmol/L IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE顯示外源基因編碼的重組N蛋白在宿主菌中表達(dá)效率較高。Western-Blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組N蛋白具有反應(yīng)原性。將純化的重組N蛋白包被酶標(biāo)板，建立并優(yōu)化了能夠用于PRRSV抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；N蛋白；重組表達(dá)；間接ELISA

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的，對(duì)豬有極強(qiáng)感染性的免疫抑制性傳染病。1996年中國境內(nèi)首次分離到美洲型PRRSV[1]。一直以來PRRSV主要危害的是妊娠期的母豬和仔豬，在2006年變異的PRRSV（HPPRRSV）顯示出了更強(qiáng)的致病性，除了妊娠期的母豬和仔豬以外，包括公豬在內(nèi)的其他豬只也會(huì)因感染本病毒而死亡[2-3]。PRRSV含有一個(gè)單股正鏈RNA基因組，它的全長(zhǎng)包含有9個(gè)開放閱讀框（ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7），其中ORF7編碼的N蛋白在流行的毒株中，具有較高的保守性，可與大多數(shù)美洲株和歐洲株病毒抗體起反應(yīng)[4]。

抗體依賴的病毒感染增強(qiáng)作用（ADE）[5]以及PRRSV導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生的持續(xù)性患病和免疫抑制，造成病豬發(fā)生嚴(yán)重的繼發(fā)性和持續(xù)性感染，從而使臨床癥狀出現(xiàn)多樣化。因此建立準(zhǔn)確而有效的PRRS檢測(cè)方法，有利于制定有效的PRRSV防控策略。

本研究應(yīng)用原核表達(dá)并純化的PRRSV JX株N蛋白作為包被抗原，建立并優(yōu)化了能夠有效檢測(cè)PRRSV抗體的間接ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶Bam HI，Hind III，質(zhì)粒提取試劑盒，T4 DNA連接酶，購自TaKaRa公司；TRIZol，購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購自Promega公司。

1.2 病毒、宿主菌、質(zhì)粒和陽性血清 豬繁殖與呼吸綜合征病毒JX株，原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a，動(dòng)物疫病診斷聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌（E.coli）Rosetta，Top10，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PRRSV陽性血清，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7基因擴(kuò)增參照J(rèn)X株P(guān)RRSV編碼N蛋白的ORF7基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，設(shè)計(jì)的引物名稱、序列見表1。

表1 PRRSV的引物名稱和序列

提取JX株豬PRRSV核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：30℃5min，42℃60min，70℃15min，94℃預(yù)變性3min后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，循環(huán)參數(shù)是94℃變性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。擴(kuò)增目的片段-20℃保存。

1.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建與測(cè)序分析 對(duì)于表達(dá)載體pET-32a和上述目的片段，分別使用限制性內(nèi)切酶BamH I，Hind III在37℃條件下作用5 h，之后在16℃條件下用連接酶連接過夜后，轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑取單菌落，菌落PCR鑒定后送測(cè)序。將序列比對(duì)正確的陽性菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并命名為pET-32a-JX-N。

1.5 重組N蛋白的表達(dá)與純化 將提取的pET-32a-JX-N重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta表達(dá)工程菌種中，在恒溫空氣震蕩搖床中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在菌液OD600nm

值為0.6時(shí)加入一定濃度的IPTG，在加入IPTG前取少量菌液作為未表達(dá)的陰性對(duì)照。取誘導(dǎo)后以及未誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行裂解煮樣后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果來判定重組蛋白是否表達(dá)，并通過改變重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG的終濃度及培養(yǎng)溫度等條件來改變?cè)撝亟M蛋白表達(dá)性質(zhì)，以期獲得最佳表達(dá)條件。

對(duì)于收集的菌體利用超聲進(jìn)行裂解，取裂解產(chǎn)物上清通過His·Bind試劑盒進(jìn)行純化。

將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將目的條帶電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，以PRRSV感染的豬血清作為一抗進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果來判定該重組蛋白的反應(yīng)原性。

1.6 重組N蛋白間接ELISA方法的建立 本研究中利用棋盤滴定法分別對(duì)抗原包被濃度及包被條件，最佳封閉液種類及一抗稀釋度，二抗稀釋度等條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1.7 陰陽性臨界值的確定 在摸索的間接ELISA方法最佳條件下，隨機(jī)檢測(cè)30份臨床PRRSV抗體陰性血清，顯色后讀取OD450nm值，計(jì)算30份陰性血清OD450nm的平均值（-x）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），以-x+3SD作為該方法判定陰陽性的臨界值，即當(dāng)待檢血清OD450nm值高于此臨界值時(shí)判為陽性，否則為陰性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別選取5份陽性及陰性PRRSV血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)血清重復(fù)3個(gè)酶標(biāo)孔，用同一次包被的酶標(biāo)板進(jìn)行板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；另外將重組蛋白分別在不同時(shí)間段包被酶標(biāo)板，同樣分別利用5份PRRSV陰陽性血清作為一抗，檢測(cè)板間重復(fù)性，分別計(jì)算板內(nèi)和板間變異系數(shù)。

1.9 特異性試驗(yàn) 用建立的間接ELISA方法分別檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、口蹄疫病毒、豬流行腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬瘟病毒的陽性血清，判定該方法對(duì)于檢測(cè)PRRSV抗體的特異性。

1.10 間接ELISA符合率試驗(yàn) 利用本研究建立的間接ELISA方法檢測(cè)30份豬血清樣品，同樣條件下用IDEXX公司的PRRSV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)。并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行以下處理，統(tǒng)計(jì)二者檢測(cè)的陽性數(shù)與二者檢測(cè)的陰性數(shù)，相加后與檢測(cè)總數(shù)相除得到符合率。

1.11 間接ELISA與中和試驗(yàn)比較 利用中和試驗(yàn)測(cè)定30份豬血清樣品的中和效價(jià)，同時(shí)對(duì)這30份豬血清樣品從1∶2依次倍比稀釋至1∶256后用本試驗(yàn)所建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得其ELISA效價(jià)，與先前的中和效價(jià)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白基因片段擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)PRRSV編碼N蛋白的ORF7基因片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，1.25%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大?。?67 bp）一致（圖1）。

圖1 RFF7基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果1：目的片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；M：DL-2 000DNA分子Marker

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白原核表達(dá)重組載體構(gòu)建及質(zhì)粒序列分析 目的片段和表達(dá)載體pET-32a分別經(jīng)BamH I，Hind III進(jìn)行雙酶切后，連接并轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落送去公司測(cè)序，經(jīng)過比對(duì)分析，該測(cè)序結(jié)果與與預(yù)期結(jié)果一致。將測(cè)序正確的陽性菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后成功提取了pET-32a-JX-N質(zhì)粒。

2.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta工程菌，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并擴(kuò)大至200mL含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600nm值升至0.6后，加入終濃度為0.7mmol/L的IPTG，在37℃空氣搖床中進(jìn)行5 h的誘導(dǎo)表達(dá)。SDSPAGE結(jié)果顯示，該重組蛋白在此誘導(dǎo)條件下主要為上清表達(dá)，且經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色后在30 kDa處可見目的蛋白條帶（圖2）。使用His·Bind試劑盒純化后得到高純度的目的蛋白（圖3）。

經(jīng)過Western-Blot檢測(cè)，根據(jù)蛋白Marker判定在約30 kDa處有預(yù)期條帶（圖4）。表明該重組N蛋白的反應(yīng)原性較好。

2.4 重組N蛋白間接ELISA方法的建立 對(duì)于建立ELISA過程中的各個(gè)條件進(jìn)行摸索，優(yōu)化結(jié)果如下：抗原最佳包被濃度為0.64μg/mL，最佳包被條件為37℃作用2 h加4℃過夜；較為理想的封閉液為5%脫脂奶；合適的血清稀釋度為1∶80；HRP標(biāo)記的rec Protein G按照1∶1 000倍稀釋最佳。

2.5 臨界值的確定 經(jīng)對(duì)30份PRRSV陰性血清進(jìn)行測(cè)定，確定樣本臨界值為0.32。

圖2 SDS-PAGE電泳結(jié)果M：低分子量蛋白Marker；1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體上清；2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體上清；3：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體沉淀；4：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的沉淀

圖3 純化后的重組蛋白M：低分子量蛋白Marker；1：純化后的重組蛋白

圖4 Western-Blot試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 經(jīng)測(cè)定計(jì)算，板內(nèi)變異系數(shù)為1.07%～5.67%，板間變異系數(shù)為1.16%～4.27%，均小于10%，證明該方法重復(fù)性良好。

2.7 特異性試驗(yàn) 特異性試驗(yàn)的結(jié)果顯示：豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性血清OD450nm值高于臨界值，為陽性。檢測(cè)的PCV-2、FMDV、PEDV、TGEV和CSFV陽性血清OD450nm值均小于0.32，為陰性。

2.8 間接ELISA符合率試驗(yàn) 根據(jù)本研究建立的間接ELISA方法在檢測(cè)30份豬血清臨床樣本的基礎(chǔ)上，同時(shí)用IDEXX公司的PRRSV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行對(duì)照，對(duì)比得出二者的符合率為93%。對(duì)于30份豬血清臨床樣本檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 N蛋白間接ELISA與IDEXX檢測(cè)結(jié)果比較

2.9 間接ELISA與中和試驗(yàn)比較 對(duì)30份豬血清同時(shí)使用本研究建立的間接ELISA方法和中和試驗(yàn)進(jìn)行抗體檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

表3 N蛋白間接ELISA與中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)于N蛋白進(jìn)行了重組表達(dá)并利用其作為包被抗原，建立了可用于PRRSV抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。

中國境內(nèi)流行的PRRSV主要為美洲株，國內(nèi)趙耘等鑒定到歐洲型PRRSV分離株的存在[6]，因而作為間接ELISA方法檢測(cè)用的包被抗原N蛋白是首選蛋白。

在間接ELISA方法建立過程中，通過對(duì)反應(yīng)條件的探索，初步建立了針對(duì)PRRSV抗體的間接ELISA方法，對(duì)于檢測(cè)過程中發(fā)生假陽性的現(xiàn)象，通過調(diào)整PBST洗滌次數(shù)，由初期洗滌3次改為洗滌5次，產(chǎn)生假陽性的現(xiàn)象明顯減少，同時(shí)板內(nèi)變異系數(shù)也相應(yīng)降低。究其原因主要是對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)孔用PBST洗滌5次比洗滌3次更加徹底，前者能夠降低非特異性結(jié)合現(xiàn)象的發(fā)生，從而增加了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

對(duì)30份豬血清樣品，同時(shí)利用本研究所建立的間接ELISA方法和中和試驗(yàn)檢測(cè)PRRSV抗體的結(jié)果，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析后顯示二者沒有相關(guān)性。其主要原因是豬在感染PRRSV后1周左右就能產(chǎn)生特異性抗體，但這些抗體并非中和抗體，中和抗體產(chǎn)生較晚，而且機(jī)體產(chǎn)生量較低。中和試驗(yàn)只能檢測(cè)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體，這也就解釋了檢測(cè)結(jié)果中間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果為陽性而中和試驗(yàn)檢測(cè)為陰性的現(xiàn)象。

間接ELISA符合率試驗(yàn)顯示，本研究建立的間接ELISA方法與進(jìn)口試劑盒具有較高的符合率，有望應(yīng)用于PRRSV抗體的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，同時(shí)重組N蛋白的表達(dá)和純化也為單克

隆抗體的制備打下了基礎(chǔ)。

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S852.65+1

A

0529-6005（2015）11-0049-03

2015-06-11

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“動(dòng)物疫病核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備關(guān)鍵技術(shù)研究（201310253）

王麒文（1990-），男，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物檢驗(yàn)檢疫，E-mail：13718231269@163.com

張樂萃，E-mail：lczhang@qau.edu.cn