王 彬，李曉齊，曹 紅，陳福勇，王永強(qiáng)，鄭世軍

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100193）

禽白血病J亞群病毒GP85蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

王 彬，李曉齊，曹 紅，陳福勇，王永強(qiáng)，鄭世軍

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100193）

為制備能夠區(qū)分禽白血病A亞群和J亞群病毒的單克隆抗體，將J亞群病毒gp85基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)攜帶His標(biāo)簽的禽白血病J亞群GP85融合蛋白，用復(fù)性純化的融合蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠。4次免疫后取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合，經(jīng)過3次亞克隆后獲得1株穩(wěn)定分泌針對GP85蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3B6。經(jīng)間接ELISA測定，小鼠腹水效價為6.4×105，親和力解離常數(shù)（kD）為2.18× 10-9，這株單抗的亞型為IgG1。通過Western Blot和IFA實(shí)驗(yàn)證實(shí)該株單抗是針對J亞群病毒蛋白GP85的特異性抗體。初步確定此株單克隆抗體的抗原識別區(qū)位于GP85蛋白N端的1-50位氨基酸。該株單抗的制備為ALV-J病毒抗原檢測以及致病機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。

禽白血病病毒；GP85；單克隆抗體

J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒引起的一類以生長抑制、免疫抑制和骨髓細(xì)胞癌變?yōu)樘卣鞯膫魅拘阅[瘤性疾病[1]，主要引起肉雞的骨髓細(xì)胞瘤[2]。J亞群禽白血病自1988年首次發(fā)現(xiàn)以來在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[3]。經(jīng)垂直傳播感染的雛雞容易發(fā)生免疫抑制，降低其對其他病原的抵抗力和疫苗的免疫效果，引起更嚴(yán)重的危害[4]。

Pol基因編碼病毒的整合酶與反轉(zhuǎn)錄酶；env基因編碼病毒囊膜蛋白GP85和GP37。GP85為病毒囊膜表面糖蛋白，通過與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合引起GP37構(gòu)象的改變，進(jìn)而引起病毒與宿主細(xì)胞的膜融合[9]。同時gp85基因編碼的蛋白是禽白血病

J亞群病毒的特異性抗原蛋白，可以作為檢測禽白血病J亞群病毒特異性抗體的診斷抗原[10]。各種亞型禽白血病病毒的gag和pol同源性為96%～97%，而A-E亞群病毒與J亞群病毒在gp85基因上的同源性為40%左右[11]，這為制備可以用于區(qū)分臨床常見的外源性禽白血病病毒ALV-A和ALV-J提供了可能。本研究成功制備抗J亞群病毒GP85蛋白的單克隆抗體，可以用于鑒別ALV-A和ALV-J病毒，并且為進(jìn)一步研究ALV的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種、毒株、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物 質(zhì)粒pGEX-6P-1-gp85、pET-32a-gp85，ALV-J gp85基因，GP85-His，GP85-GST，DH5-α、BL21，DF-1細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、禽白血病J亞群病毒CAUHM01株和A亞群病毒BJY01株均由本實(shí)驗(yàn)室保存；6-8周齡雌性BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 限制性內(nèi)切酶、LA Taq酶和DNA連接酶，購自TaKaRa公司；His單克隆抗體；高純單克隆抗體、抗GST單克隆標(biāo)體，購自Abmart公司；山羊抗小鼠IgG二抗，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；兔抗雞IgG二抗，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自Gibco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購自Hy?clone公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT和 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，均購自Sigma公司；Centrifuge5810R型低溫冷凍高速離心機(jī)，購自Eppendorf公司；Alpha ImagerTM2200型凝膠成像分析儀，購自美國Alpha公司；KoDak醫(yī)學(xué)X光顯影機(jī)102型，購自美國KoDak公司；Sunrise 96孔酶標(biāo)儀，購自TECAN公司；XDS-1B倒置顯微鏡，購自重慶光學(xué)儀器廠。

1.3 抗GP85單克隆抗體的制備 用純化得到的GP85-His蛋白免疫小鼠[14]。小鼠血清效價大于1∶10 000時，無菌狀態(tài)下取免疫小鼠的脾臟，分離脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，隨后進(jìn)行陽性克隆篩選、亞克隆[15]。

1.4 抗GP85單克隆抗體的鑒定

1.4.1 單克隆抗體亞型鑒定 按照Sigma公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鑒定試劑盒說明書進(jìn)行亞型鑒定。

1.4.2 單克隆抗體特異性鑒定 誘導(dǎo)表達(dá)ALVGP85、CIAV-VP2、REV-GP90、IBDV-VP4、ARV-V原核蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以制備的抗GP85單抗為一抗，進(jìn)行Western Blot檢測。

1.4.3 單克隆抗體親和力鑒定 參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行親和力解離常數(shù)（kD）的測定。

1.4.4 Western Blot鑒定 將DF-1細(xì)胞以5×104個/孔接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%時，以ALV-J或ALV-A病毒接種細(xì)胞，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對照。7 d后收取細(xì)胞裂解總蛋白，進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.4.5 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定 按照1.4.4所述方法進(jìn)行病毒感染，參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。

1.4.6 抗原識別區(qū)分析 將gp85基因按180個堿基的間距分別從N端和C端進(jìn)行截短，構(gòu)建到pET-28a載體上，進(jìn)行原核表達(dá)。用Western Blot方法鑒定3B6株單抗抗原表位識別區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 抗GP85單克隆抗體的制備與亞型鑒定 小鼠經(jīng)3次免疫，用間接ELISA方法測定小鼠血清效價為1∶12 800。加強(qiáng)免疫后，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過3次亞克隆，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗GP85早抗的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3B6。將雜交瘤細(xì)胞注射到經(jīng)產(chǎn)BALB/c母鼠腹腔內(nèi)制備腹水，間接ELISA測定小鼠腹水效價為6.4×105，用Sigma公司的ELISA亞型鑒定試劑盒檢測表明，此株單克隆抗體的亞型為IgG1。

2.2 抗GP85單克隆抗體特異性檢測與親和力鑒定 抗GP85單克隆抗體可以識別ALV-GP85蛋白，不識別CIAV-VP2、REV-GP90、IBDV-VP4、ARV-σB蛋白（圖1A），表明獲得的單克隆抗體具有良好的特異性。親和力檢測結(jié)果表明，此株單抗的親和力解離常數(shù)（kD）為2.12×10-9（圖1B），屬于高親和力的單抗。

2.3 抗GP85單克隆抗體識別ALV-JGP85蛋白

用Western Blot方法檢測ALV-J感染DF-1細(xì)胞（圖2A），試驗(yàn)結(jié)果表明，該株單抗能特異性識別ALV-J亞群病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的GP85蛋白。以間接免疫熒光試驗(yàn)檢測，結(jié)果同樣表明該株單抗能特異性識別ALV-J亞群病毒感染DF-1細(xì)胞產(chǎn)生的GP85蛋白，不能識別ALV-A亞群病毒感染DF-1細(xì)胞產(chǎn)生的GP85蛋白（圖2B）。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，3B6株單抗能較好的區(qū)分ALV-J亞群和A亞群病毒。

圖1 抗GP85單克隆抗體特異性和親和力測定A：單克隆抗體的特異性分析；B：3B6株單抗親和力測定

圖2 單抗3B6株識別ALV-J感染產(chǎn)生的GP85蛋白A：禽白血病J亞群GP85蛋白的Western Blot檢測；B：禽白血病J亞群和A亞群病毒GP85蛋白的IFA檢測

2.4 單克隆抗體抗原識別區(qū)的確定 用抗His標(biāo)簽抗體作為一抗，Western Blot檢測表明GP85截短蛋白均可以表達(dá)（圖3B）。以3B6單克隆抗體為一抗，通過Western Blot分析3B6株抗體識別的抗原表位所在區(qū)域?yàn)镚P85蛋白N端第1-50位氨基酸（圖3C、D）。

3 討論

禽白血病J亞群自從20世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)以來，表現(xiàn)出很強(qiáng)的流行性和致病性。西方國家在禽白血病的凈化上取得了很大成功[18]，然而禽白血病在我國卻長期存在，目前不僅在肉雞中存在廣泛傳播，并且在產(chǎn)蛋雞群中也出現(xiàn)了流行[19]。禽白血病目前沒有有效的疫苗，也無特效的治療藥物，對白血病進(jìn)行快速檢測就顯得尤為重要。我國流行的禽白血病主要由A、B亜群和J亞群病毒引起，近幾年J亞群禽白血病出現(xiàn)流行趨勢增強(qiáng)及危害程度日趨嚴(yán)重的狀況[20]。為解決這些問題，我們針對ALVJGP85蛋白制備單克隆抗體，探索建立快速檢測禽白血病的方法，并區(qū)分A亞群和J亞群禽白血病病毒。

禽白血病的A、B、C、D、E、J6個亞群的gag和pol基因高度保守，同源性在90%[21]以上，而env基因的同源性在40%左右[22]，并且env中的gp85基因編碼的蛋白是禽白血病J亞群的特異性抗原蛋白[23]，所以我們研制禽白血病J亞群特異性抗體時選擇了GP85蛋白。雖然國內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)室都成功研制了抗GP85蛋白的單克隆抗體[24-27]，但gp85基因存在易發(fā)生變異的2個高變區(qū)和3個可變區(qū)，同時GP85蛋白存在多個抗原表位，再者不同抗體的親和力不同，使用范圍和目的也就不同，因此制備針對不同毒株GP85蛋白的單克隆抗體仍具有重要意義。

圖3 單抗抗原表位識別區(qū)分析A：gp85基因截短模式圖（△1-△6）；B：抗His標(biāo)簽單克隆抗體檢測GP85截短蛋白的表達(dá)；C：抗GP85單克隆抗體檢測抗體識別區(qū)；D：抗GP85單克隆抗體識別區(qū)模式圖

我們將克隆的ALV-J gp85基因與NCBI上傳的20個ALV-A gp85基因進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)同源性在30%～40%，氨基酸同源性高的區(qū)域主要集中在gp85基因的N端和C端。為了保證GP85蛋白的免疫活性，我們在表達(dá)GP85蛋白免疫小鼠時并沒有將GP85蛋白進(jìn)行截短表達(dá)，而是在表達(dá)篩選蛋白GP85-GST時去除了N端50個和C端30個與禽白血病A亞群病毒同源性較高的氨基酸序列，保證除去與禽白血病A亞群GP85蛋白有連續(xù)4個氨基酸以上相同的氨基酸序列，這樣篩選出的單克隆抗體不會識別與ALV-A GP85相同的抗原表位，進(jìn)一步保證了研制的單克隆抗體的群特異性。IFA檢測結(jié)果也表明，該株單抗可以很好的區(qū)分ALV-A病毒和ALV-J病毒。本研究并對所制備的抗GP85單克隆抗體的亞型、特異性、親和力和抗原表位做了詳細(xì)分析，為ALV致病機(jī)理的研究以及快速檢測試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)

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Development and identification ofmonoclonalantibodies against Avian Leukosis Virus（ALV）subgroup JGP85

WANG Bin，LIXiao-qi，CAOHong，CHEN Fu-yong，WANG Yong-qiang，ZHENG Shi-jun
（State Key Laboratory of Agrobiotechnology，College of VeterinaryMedicine，China AgriculturalUniversity，Beijing 100193，China）

To develop monoclonal antibodies（McAbs）that can distinguish avian leukemia subgroup A virus from subgroup J virus,we cloned gp85 gene into prokaryotic expression vectors pET-32a and pGEX-6P-1.The expression vectors were transformed into E.coli BL21 for expression of GP85.The purified and refolded fusion protein GP85-Hiswas used as an immunogen to vacci?nate BALB/cmice.Then，we fused myeloma cells SP2/0 with splenocytes from the immunized BALB/cmice after four times of im?munization.A fter three rounds of subcloning,we obtained a hybridoma cell clone that stably secreted McAbs against GP85 and named 3B6.Antibody titers were 6.4×105as examined by indirect ELISA in ascite fluid ofmice inoculated intraperitoneally with monoclonal antibody-producing hybridoma cells.The dissociation constant（kD）of themonoclonal antibody was determined to be 2.18×10-9and the isotypewas IgG1.Specific recognition of GP85 by anti-GP85monoclonal antibodywas validated by Western Blot and indirect Fluorescence Antibody assay.The epitope in GP85 thatwas recognized by 3B6 was located between 1 to 50 aa as dem?onstrated by Western Blot.The McAb will be helpful to the examination of ALV-J antigen and to elucidate the pathogenesis of ALV.

ALV；GP85；monoclonalantibody

s：WANG Yong-qiang；ZHENG Shi-jun

S852.65+9.3

A

0529-6005（2015）11-0023-04

2014-08-04

國家自然科學(xué)基金（#31272543）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（#NYCYTX-41）

王彬（1988-），男，博士生，主要從事病原與宿主相互作用機(jī)制的研究，E-mail：6942362@163.com

王永強(qiáng)，E-mail：vetwyq@cau.edu.cn；鄭世軍，E-mail：sjzheng@cau.edu.cn