周俐斐， 蘆柏震， 陳峰陽， 何福根， 何俏軍

（1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310058；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江杭州310022；3.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，浙江杭州310013）

清肺合劑的清除自由基和抗氧化作用

周俐斐1，2， 蘆柏震2， 陳峰陽3， 何福根2， 何俏軍1*

（1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310058；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江杭州310022；3.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，浙江杭州310013）

目的 研究清肺合劑的清除自由基和抗氧化作用，從抗氧化應(yīng)激角度探討其治療肺癌的機(jī)制。方法 采用DPPH、羥自由基和超氧陰離子自由基考察清肺合劑的清除自由基作用。采用總抗氧化能力、脂質(zhì)過氧化水平和亞鐵離子絡(luò)合能力考察清肺合劑的抗氧化作用。結(jié)果 清肺合劑分別在0.13、0.26、1.05 mg/mL以上質(zhì)量濃度對(duì)DPPH、羥基自由基和超氧陰離子自由基表現(xiàn)出劑量依賴性地清除作用。在0.26 mg/mL以上質(zhì)量濃度表現(xiàn)出劑量依賴性的提高總抗氧化能力和抗脂質(zhì)過氧化能力。在0.13mg/mL以上質(zhì)量濃度能劑量依賴性地絡(luò)合亞鐵離子。結(jié)論 清肺合劑對(duì)DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除能力，還具有較強(qiáng)的總抗氧化能力，抗脂質(zhì)過氧化能力和金屬離子絡(luò)合能力。

清肺合劑；肺癌；氧化應(yīng)激

氧化反應(yīng)為機(jī)體提供能量，是必不可少的生物過程。但是，當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)的抗氧化防御體系難以清除生物氧化過程產(chǎn)生的過多活性氧 （ROS），即會(huì)引起各種生物大分子的氧化應(yīng)激損傷，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA等，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化以及相關(guān)蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞、組織損傷或基因突變。這些氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是多種心血管、老年性和免疫性等疾病的重要致病因素［1］。在腫瘤的起始（initiation）、促進(jìn)（promotion）和演變（progression）三個(gè)階段中，氧化應(yīng)激同樣具有非常重要的作用。在起始階段，氧化應(yīng)激引起DNA損傷，轉(zhuǎn)錄和復(fù)制錯(cuò)誤，遺傳基因變異，從而使正常細(xì)胞癌變。在促進(jìn)階段，活性氧（ROS）通過ERK/MEK和PI3K/AKT等通路激活NF-κB、Nrf2、HIF、p53等核轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和免于凋亡。在演變階段，ROS促進(jìn)血管生成，上調(diào)金屬蛋白酶 （MMP），從而參與腫瘤的轉(zhuǎn)移［2］。

清肺合劑 （原名中肺合劑）是我院 （浙江省腫瘤醫(yī)院）幾代中醫(yī)藥工作者經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐研制、歸納、提煉出來的經(jīng)驗(yàn)方制成的醫(yī)院制劑，具有清熱化痰解毒、軟堅(jiān)散結(jié)和活血之功效，目前主要用于晚期肺癌的治療，早、中期肺癌的輔助治療以及肺癌、肺炎、放射性肺炎引起的咳嗽多痰、胸痛、咳血等癥的治療。在我院已有40年（1973年開始研制）的應(yīng)用歷史，并深受臨床醫(yī)生和病人的認(rèn)可［3-7］。

為了更多的明確該制劑的作用機(jī)制，本研究通過測定清除自由基和抗氧化能力，從抗氧化防御角度探討了清肺合劑的抗腫瘤作用，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 試劑與材料

1.1 清肺合劑 浙藥制字Z20100019，由浙江省腫瘤醫(yī)院中藥制劑室提供。處方組成：浙貝母41 g、白花蛇舌草110 g、龍葵110 g、重樓36 g、半枝蓮110 g、白茅根110 g、仙鶴草55 g、夏枯草55 g、防己41 g、天龍3 g。制法：以上十味，加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1.5 h，合并煎液，放置使沉淀，取上清液，加入苯甲酸鈉3 g和冰糖178 g，混勻，放置使沉淀，取上清液，濾過，濃縮至1 000 mL，分裝、滅菌，即得。質(zhì)量濃度以投入生藥計(jì)算，成品質(zhì)量濃度為671 mg/mL。臨實(shí)驗(yàn)前，樣品以生理鹽水稀釋至供試濃度。

1.2 試劑 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）和菲咯嗪（ferrozine）購自美國Sigma Aldrich公司。維生素E（Vit-E）和維生素C（Vit-C）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。總抗氧化能力 （T-AOC）檢測試劑盒，超氧陰離子自由基，羥基自由基和丙二醛 （MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH自由基清除能力測定根據(jù)Yokozawa等人描述的方法略做改進(jìn)［8-9］。在96孔板中加入100μL 0.5 mmol/L新配制的DPPH自由基無水乙醇溶液，再加入100μL不同梯度質(zhì)量濃度的清肺合劑稀

釋液，設(shè)置空白對(duì)照和陽性對(duì)照，空白對(duì)照加入100μL生理鹽水，陽性對(duì)照加入100μL質(zhì)量濃度為25μg/mL的維生素C溶液，各復(fù)3孔。搖勻后避光室溫反應(yīng)30 min，酶標(biāo)儀517 nm測吸光度，吸光度值越低表示自由基清除能力越強(qiáng)。

2.2 羥自由基清除能力的測定 根據(jù)羥基自由基檢測試劑盒說明，采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，用Griess試劑顯色。設(shè)置空白對(duì)照和維生素C陽性對(duì)照，各濃度樣品復(fù)3管。

2.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定 根據(jù)超氧陰離子自由基檢測試劑盒說明，采用黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，用Griess試劑顯色。設(shè)置空白對(duì)照和維生素C陽性對(duì)照，各濃度樣品復(fù)3管。

2.4 總抗氧化能力（T-AOC）的測定 按總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒說明，以FRAP法（Fe3+還原成Fe2+的能力測定法）測定。設(shè)置空白對(duì)照和維生素C陽性對(duì)照，各濃度樣品復(fù)3管。

2.5 抗脂質(zhì)過氧化測定［9］在大鼠肝勻漿組織中以Fe2+-維生素C誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，以硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛 （MDA）的量來反映脂質(zhì)過氧化的水平。取供試品200μL，先加入10%的大鼠肝勻漿400 μL，后加800μmol/L的維生素C和200μmol/L FeCl2溶液各100μL，振蕩均勻后37℃反應(yīng)1.5 h。取反應(yīng)后的勻漿100μL，按MDA測定試劑盒說明操作。以維生素E為陽性對(duì)照，各劑量樣品復(fù)3管，計(jì)算抑制率。

2.6 亞鐵離子絡(luò)合能力［9］采用菲咯嗪試劑測定，F(xiàn)e2+與菲咯嗪試劑能形成紅色絡(luò)合物，在562 nm處有最大吸收。96孔板中，加供試品100μL和0.25 mmol/L的FeCl2溶液50μL，設(shè)置空白對(duì)照和EDTA陽性對(duì)照，常溫反應(yīng)10 min后，加1 mmol/L的菲咯嗪50μL，562 nm測吸光度。各濃度樣品復(fù)3孔，計(jì)算抑制率。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析 所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用t檢驗(yàn)法和one-way ANOVA方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 清肺合劑對(duì)DPPH自由基的清除作用 DPPH是一種以氮為中心的自由基，無論是給出電子或者得到氫被還原時(shí)溶液顏色會(huì)由紫色變?yōu)辄S色。作為一種穩(wěn)定的自由基，本實(shí)驗(yàn)首先采用DPPH自由基研究清肺合劑的自由基清除能力，結(jié)果見圖1。清肺合劑稀釋5 120倍 （0.13 mg/mL）后還有近5%的清除能力，5 120～160倍稀釋液 （0.13～4.19 mg/mL）能劑量依賴性地清除DPPH自由基，且呈較好的線性關(guān)系 （r=0.985）。

3.2 清肺合劑對(duì)羥基自由基的清除作用 在所有的含氧自由基中，羥基自由基是生物體系內(nèi)最活潑的自由基，其在自由基病理學(xué)中被公認(rèn)為是最具有破壞力的自由基，幾乎可以破壞活細(xì)胞內(nèi)的一切分子。如同對(duì)DPPH自由基一樣，清肺合劑2 560～160倍稀釋液（0.26～4.19mg/mL）能劑量依賴性地清除羥基自由基 （圖2）。

圖1 清肺合劑對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖2 清肺合劑對(duì)羥基自由基的清除作用

3.3 清肺合劑對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 超氧陰離子自由基是較弱的自由基，但它在強(qiáng)而有危害的活性氧如過氧化氫、羥基自由基和單線態(tài)氧的形成過程中起著非常重要的作用。相比對(duì)羥基自由基極強(qiáng)的清除能力，清肺合劑對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力相對(duì)較弱，但在稀釋640倍 （1.05mg/mL）以上的質(zhì)量濃度也能劑量依賴性地顯著抑制超氧陰離子自由基的產(chǎn)生 （圖3）。

圖3 清肺合劑對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

3.4 清肺合劑的總抗氧化能力（T-AOC） 清肺合劑的總抗氧化能力結(jié)果如圖4所示，清肺合劑稀釋2 560倍（0.26mg/mL）以上質(zhì)量濃度表現(xiàn)出劑量依賴性的提高總抗氧化能力的作用。

3.5 清肺合劑對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用 脂質(zhì)過氧化是引起各種病理結(jié)果的直接因素。清肺合劑2 560～160倍稀釋液（0.26～4.19 mg/mL）能劑量依賴性地抑制大鼠肝勻漿中Fe2+-維生素C誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng) （圖5）。

圖4 清肺合劑的總抗氧化能力

圖5 清肺合劑對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

3.6 清肺合劑的亞鐵離子絡(luò)合能力 金屬絡(luò)合能力因可以減少脂質(zhì)過氧化中催化金屬的濃度而產(chǎn)生重要的抗氧化作用。Fe2+是各種催化金屬離子中最強(qiáng)的助氧化劑，因此本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了清肺合劑與菲咯嗪競爭絡(luò)合Fe2+的能力，結(jié)果見圖6。清肺合劑 5 120～20倍稀釋液 （0.13～33.55 mg/mL）能劑量依賴性地絡(luò)合Fe2+。

圖6 清肺合劑的亞鐵離子絡(luò)合能力

4 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率居世界首位，其病因病理復(fù)雜。由于肺在生理結(jié)構(gòu)上是最易受內(nèi)外環(huán)境ROS影響的組織器官，因此，較其他組織器官，ROS的氧化應(yīng)激在肺癌的發(fā)病過程中具有更重要的作用。如據(jù)流行病學(xué)調(diào)查：長期吸煙會(huì)誘導(dǎo)氣管炎癥，白細(xì)胞堆積和激活，產(chǎn)生大量的ROS，損傷細(xì)胞膜，引起蛋白質(zhì)和DNA突變，大大增加患肺癌的概率。其他致肺癌的環(huán)境因素如石棉、多環(huán)芳香族化合物等同樣通過ROS氧化應(yīng)激引起細(xì)胞DNA的斷裂、序列錯(cuò)位、拷貝數(shù)改變或甲基化等。ROS參與腫瘤發(fā)病的機(jī)制被認(rèn)為與細(xì)胞色素-P、谷光苷肽S-轉(zhuǎn)移酶、組蛋白脫乙酰酶、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶等分子反應(yīng)，引起EGFR、RAS、p53等通路的改變有關(guān)［10］。

清肺合劑以軟堅(jiān)散結(jié)、止咳化痰止痛為原則，用重樓、浙貝母、白花蛇舌草、半枝蓮、龍葵等清熱解毒、消腫止痛以抗癌；仙鶴草收斂止血、解毒抗癌并治素體虛損而固本；白茅根涼血止血并治熱病煩渴。綜合全方，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，群藥相伍，共奏清熱解毒、開郁化痰、止咳平喘、祛瘀散結(jié)、固本止痛之效。多年的臨床觀察表明，清肺合劑在肺癌和肺炎的治療中，對(duì)改善患者的臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，減輕化療的毒副反應(yīng)等方面具有臨床意義［3-7］。前期實(shí)驗(yàn)研究表明清肺合劑抗腫瘤的機(jī)制主要有：①抑制鼠腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；②通過降低腫瘤組織基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)和降低腫瘤組織微血管密度 （MVD）而抑制腫瘤新生血管的生成［11-13］。

本研究對(duì)其抗腫瘤的機(jī)制從抗氧化應(yīng)激角度進(jìn)一步做了探討，結(jié)果顯示清肺合劑具有較好的清除自由基和抗氧化能力。該復(fù)方制劑由于組分復(fù)雜，尚未能闡明其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。但有研究認(rèn)為，大多數(shù)植物提取物的清除自由基和抗氧化能力與其含有的酚酸類和黃酮類物質(zhì)有關(guān)［14-15］。HPLC和薄層色譜測定發(fā)現(xiàn)清肺合劑中除含1 mg/L以上的防己諾林堿和粉防己堿外［16］，還含有綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、迷迭香酸和齊墩果酸等酚酸類物質(zhì)及黃酮類物質(zhì)野黃芩苷［17-18］。這類物質(zhì)可作為電子供體阻斷自由基鏈反應(yīng)，從而發(fā)揮清除自由基和抗氧化能力。

綜上所述，清肺合劑的抗氧化應(yīng)激能力可能是其臨床治療肺癌的機(jī)制之一。由于清肺合劑中成分多種復(fù)雜，其活性的主要成分有待進(jìn)一步研究。由于氧化應(yīng)激參與肺癌的起始、促進(jìn)和演變各階段，分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，因此，清肺合劑調(diào)控ROS抗肺癌的分子機(jī)制也需要作深入研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2527-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.044

2014-05-16

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃 （2012ZA021）

周俐斐（1984—），女，碩士生，主管中藥師，從事中藥藥理學(xué)研究。E-mail：feifei1984_zhou@126.com

*通信作者：何俏軍 （1970—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事抗腫瘤藥理學(xué)研究。Tel：（0571）88208400，E-mail：qiaojunhe@zju. edu.cn