劉 娟， 周勤梅， 彭 成， 劉露絲， 熊 亮*， 劉昭華

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137；2.成都第一藥業(yè)有限公司，四川成都610031）

［成分分析］

細(xì)葉益母草化學(xué)成分及其抗血小板聚集活性的研究

劉 娟1， 周勤梅1， 彭 成1， 劉露絲1， 熊 亮1*， 劉昭華2

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川成都611137；2.成都第一藥業(yè)有限公司，四川成都610031）

目的 對細(xì)葉益母草Leonurus sibiricus的化學(xué)成分和血小板聚集活性進(jìn)行研究。方法 細(xì)葉益母草提取液采用大孔樹脂、MCI、反相C18、硅膠、Sephadex LH-20柱色譜及重結(jié)晶等方法進(jìn)行分離純化，所得化合物的結(jié)構(gòu)通過波譜分析和TLC來鑒定，然后對其進(jìn)行抗血小板聚集活性篩選。結(jié)果 從中分離鑒定出9個(gè)化合物，分別為益母草堿（1）、丁香脂素 （2）、梣皮樹脂醇 （3）、蒙花苷 （4）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 （5）、丁香酸乙酯 （6）、對羥基苯甲酸乙酯 （7）、對羥基芐乙醚 （8）、β-胡蘿卜苷 （9）。結(jié)論 化合物2～4、6、8均為首次從該植物中分離得到，其中3和6為首次從益母草屬植物中分離得到。而且，化合物1、4和5對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集均有明顯的抑制作用。

細(xì)葉益母草；化學(xué)成分；抗血小板聚集；二磷酸腺苷 （ADP）；分離鑒定

益母草作為一味傳統(tǒng)中藥，常用于治療月經(jīng)不調(diào)、胎漏難產(chǎn)、行經(jīng)腹痛及產(chǎn)后瘀阻等癥，素有“血家圣藥”、“經(jīng)產(chǎn)良藥”之稱。其中，細(xì)葉益母草Leonurus sibiricus為唇形科益母草屬植物，具有

活血、調(diào)經(jīng)、撥云退翳之功效［1］，是市場上除藥典收載品種益母草Leonurus japonicus外最常見的商品藥材［2］。目前，對該植物中二萜和生物堿類化合物的研究較多［3-4］，但黃酮和酚類較少［5］。本課題組前期已經(jīng)對益母草進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)了一系列活性化合物［6-14］，尤其是抗血小板聚集活性。為了進(jìn)一步研究益母草屬其他植物，并探討其化學(xué)成分的多樣性及生物活性，本實(shí)驗(yàn)對細(xì)葉益母草展開了初步研究，并對所得成分進(jìn)行抗血小板聚集活性篩選。

1 材料

MicroTOF-QⅡ型質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；Bruker-500、600型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Búchi Gradient Former B-687型中壓液相色譜儀（瑞士Buchi公司）。Sephadex LH-20（瑞士Amershan Pharmacia公司）；MCI柱色譜CHP 20P（日本Mitsubishi Chemical公司）；薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠 （青島海洋化工有限公司）。所用試劑均為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

細(xì)葉益母草于2013年8月采集于山西大同，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛教授鑒定為細(xì)葉益母草Leonurus sibiricus L.的干燥全草，標(biāo)本（SLS-0809）保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。

2 提取與分離

取干燥粉碎的細(xì)葉益母草3 kg，95%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液減壓濃縮，得浸膏240 g，混懸于水中，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，得乙酸乙酯 （95 g）和正丁醇 （40 g）部位。

乙酸乙酯部位經(jīng)石油醚-丙酮 （100：0～0：100）洗脫后，回收溶劑，得到 15個(gè)部分Fr.1～Fr.15。其中，F(xiàn)r.9經(jīng)硅膠和凝膠LH-20柱色譜分離后，通過制備薄層色譜，得到化合物7（10 mg）和8（9 mg）；Fr.15中析出白色粉末，即化合物9（28 mg）。

正丁醇部位采用D101大孔樹脂分離，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇 （10%、30%、50%、70%、95%）梯度洗脫，回收溶劑，得到5個(gè)洗脫部分A～E。其中，C經(jīng)MCI柱色譜分離，甲醇-水（20%～100%）梯度洗脫，回收溶劑，得到6個(gè)亞組分（C1～C6）。C3和C4分別經(jīng)反相中壓液相色譜分離后，析出黃色粉末，甲醇洗滌純化，得到化合物4（36 mg）和5（75 mg）；C5經(jīng)反相中壓液相、LH-20凝膠柱、硅膠柱、制備薄層以及半制備液相色譜等方法，得到化合物1（23 mg）、2（6 mg）、3（8 mg）和6（5 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色針晶（甲醇），ESI-MS m/z：312.2［M+H］+。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：4.33（2H，t，J=6.6 Hz，3-H），1.85（2H，m，4-H），1.74（2H，m，5-H），3.26（2H，t，J=7.2 Hz，6-H），7.31（2H，s，2′，6′-H），3.89（6H，s，3′，5′-OCH3）。13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：158.9（C-1），42.2（C-3），26.8（C-4），27.3（C-5），65.4（C-6），121.3（C-1′），108.3（C-2′，6′），149.3（C-3′，5′），142.6（C-4′），168.4（C-7′），57.0（C-8′，9′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［15］報(bào)道基本一致，確定化合物1為益母草堿。

化合物2：無色膠狀物，ESI-MS m/z：441.2［M+Na］+。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：3.16（2H，m，1，5-H），4.74（2H，d，J=4.2 Hz，2，6-H），4.28（2H，dd，J=9.0，6.6 Hz，4a，8a-H），3.90（2H，dd，J=9.0，3.6 Hz，4b，8b-H），6.67（4H，s，2′，6′，2″，6″-H），3.86（12H，s，3′，5′，3″，5″-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［16］報(bào)道基本一致，確定化合物2為丁香脂素。

化合物3：無色膠狀物，ESI-MS m/z：411.1［M+Na］+。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：3.16（2H，m，1，5-H），4.73（2H，d，J=4.2 Hz，2，6-H），4.26（2H，m，4a，8a-H），3.88（2H，m，4b，8b-H），6.67（2H，s，2′，6′-H），3.86（6H，s，3′，5′-OCH3），6.96（1H，d，J=1.8 Hz，2″-H），3.87（3H，s，3″-OCH3），6.78（1H，d，J=8.4 Hz，5″-H），6.83（1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，6″-H）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［17］報(bào)道基本一致，確定化合物3為梣皮樹脂醇。

化合物4：黃色粉末，ESI-MS m/z：593.2［M+H］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：6.96（1H，s，3-H），6.45（1H，d，J=1.8 Hz，6-H），6.80（1H，d，J=1.8 Hz，8-H），3.70～3.10（10H，m，Glc，Rha-H），8.06（2H，d，J=9.0 Hz，2′，6′-H），7.16（2H，d，J=9.0 Hz，3′，5′-H），3.87（3H，s，4′-OCH3），5.06（1H，d，J=7.2 Hz，1″-H），4.53（1H，brs，1?-H），1.08（3H，d，J= 6.0 Hz，6?-H），12.91（1H，brs，5-OH）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：164.3（C-2），103.9（C-3），182.0（C-4），161.5（C-5），100.2（C-6），

163.7（C-7），95.2（C-8），157.4（C-9），105.8（C-10），123.0（C-1′），128.4（C-2′，6′），114.5（C-3′，5′），162.4（C-4′），55.8（OCH3-4′），100.1（C-1″），73.4（C-2″），76.5（C-3″），70.4（C-4″），75.5（C-5″），66.3（C-6″），100.9（C-1?），70.5（C-2?），70.6（C-3?），72.3（C-4?），68.6（C-5?），17.9（C-6?）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］報(bào)道基本一致，確定化合物4為蒙花苷。

化合物5：黃色粉末，ESI-MS m/z：433.1［M +H］+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：6.87（1H，s，3-H），6.44（1H，d，J=2.4 Hz，6-H），6.83（1H，d，J=2.4 Hz，8-H），7.96（2H，d，J= 8.4 Hz，2′，6′-H），6.94（2H，d，J=8.4 Hz，3′，5′-H），5.07（1H，d，J=4.8 Hz，1″-H），12.96（1H，s，5-OH），10.40（1H，s，4′-OH）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：164.4（C-2），103.2（C-3），182.2（C-4），161.3（C-5），99.8（C-6），163.1（C-7），93.0（C-8），157.1（C-9），105.5（C-10），121.2（C-1′），128.6（C-2′），116.2（C-3′），161.5（C-4′），116.2（C-5′），128.9（C-6′），99.9（C-1″），77.4（C-3″），67.2（C-4″），76.6（C-5″），73.5（C-6″），60.4（C-7″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］報(bào)道基本一致，確定化合物5為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物6：無色針晶，ESI-MS m/z：249.1［M +Na］+。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：7.35（2H，brs，2，6-H），3.92（6H，s，3，5-OCH3），4.35（2H，q，J=7.2 Hz，1′-H），1.39（3H，t，J=7.2 Hz，2′-H）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［20］報(bào)道基本一致，確定化合物6為丁香酸乙酯。

化合物7：白色粉末，ESI-MS m/z：189.0［M +Na］+。1H-NMR（CD3COCD3，600 MHz）δ：7.88（2H，d，J=9.0 Hz，2，6-H），6.91（2H，d，J= 9.0 Hz，3，5-H），4.28（2H，q，J=7.2 Hz，1′-H），1.33（3H，t，J=6.6 Hz，2′-H）。13C-NMR（CD3COCD3，150 MHz）δ：162.6（C-1），116.0（C-2，6），132.4（C-3，5），122.8（C-4），166.6（C-7），60.9（C-1′），14.7（C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［21］報(bào)道基本一致，確定化合物7為對羥基苯甲酸乙酯。

化合物8：白色粉末，ESI-MS m/z：175.1［M+Na］+。1H-NMR（CD3COCD3，500 MHz）δ：7.16（2H，d，J=8.5 Hz，2，6-H），6.79（2H，d，J=8.5 Hz，3，5-H），4.36（2H，s，7-H），3.45（2H，q，J=7.0 Hz，1′-H），1.18（3H，t，J=7.0 Hz，2′-H）。13C-NMR（CD3COCD3，125 MHz）δ：151.5（C-1），115.8（C-2，6），130.0（C-3，5），72.8（C-7），65.7（C-1′），15.6（C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［22］報(bào)道基本一致，確定化合物8為對羥基芐乙醚。

化合物9：白色無定形粉末，與β-胡蘿卜苷對照品在3種溶劑系統(tǒng)中展開，發(fā)現(xiàn)兩者Rf值及顯色行為一致，確定化合物9為β-胡蘿卜苷。

4 抗血小板聚集活性研究

對SD大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈取血，與枸櫞酸鈉溶液按9：1的比例混合，離心10 min（800 r/min）后，取上清液，得富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）。余下部分離心10 min（3 500 r/min）后，取上清液，得貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）。然后，按照Born氏比濁法，用血小板聚集儀對二磷酸腺苷 （ADP，終質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL）誘導(dǎo)的血小板聚集率進(jìn)行測定，通過比較化合物1～9和空白組的血小板最大聚集率來評價(jià)其抗血小板聚集活性［10］。

結(jié)果顯示，化合物1、4和5具有明顯的抗血小板聚集作用，見表1。然后，計(jì)算其抑制率（AIR），計(jì)算公式為AIR=（空白對照組最大聚集率-給藥組最大聚集率）/空白對照組最大聚集率×100%。

表1 化合物對ADP誘導(dǎo)血小板聚集的影響Tab.1 Effects of com pounds on p IateIet aggregation induced by ADP

表1 化合物對ADP誘導(dǎo)血小板聚集的影響Tab.1 Effects of com pounds on p IateIet aggregation induced by ADP

注：與生理鹽水組比較，△P＜0.05；*P＜0.01

分組 濃度/（mol.L-1）樣本量 最大聚集率/ %抑制率/ % - 10 43.70±10.924 -陽性藥（氫氯吡格雷）1×10-4 10 28.50±4.790*34.78生理鹽水 - 12 33.33±8.968 -化合物1 1×10-4 12 25.50±5.649△23.49生理鹽水 - 12 34.00±9.145 -化合物4 1×10-4 12 22.50±8.361*33.82生理鹽水 - 11 33.73±9.748 -化合物5 1×10-4 11 23.82±12.032△生理鹽水29.38

5 討論

在前期對益母草L.japonicas化學(xué)成分研究［6-14］的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對細(xì)葉益母草L. sibiricus進(jìn)行化學(xué)和活性成分研究，結(jié)果從中分離出9個(gè)化合物。其中，化合物2～4、6、8為首次從該植物中得到，而且3和6為首次從益母草屬植物中得到。另外，化合物1、4和5對ADP誘導(dǎo)的

血小板聚集有明顯抑制作用，其中化合物1（益母草堿）的活性與文獻(xiàn) ［4］報(bào)道一致，而4和5與文獻(xiàn) ［23］報(bào)道的黃酮具有抑制血小板聚集及抗血栓形成的作用相符，提示這些成分可能與細(xì)葉益母草活血化瘀的功效存在一定關(guān)聯(lián)，故須作進(jìn)一步深入研究。

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Chem icaIconstituents and their anti-p IateIet aggregation activities of Leonurus sibiricus L.

LIU Juan1， ZHOU Qin-mei1， PENG Cheng1， LIU Lu-si1， XIONG Liang1*， LIU Zhao-hua2

（1.Gollege of Pharmacy，Ghengdu University of Traditional Ghinese Medicine；State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，Development and Utilization of Ghinese Medicine Resources，Ghengdu 611137，Ghina；2.Ghengdu No.1 Pharmaceutical Go.，Ltd.Ghengdu 610031，Ghina）

AIM To study the chemical constituents and their anti-platelet aggregation activities of Leonurus sibiricus L.METHODS The analysis of L.sibiricus extract was carried out on macroporous resin，MCI，ODS C18，silica，Sephadex LH-20 gel column and recrystallization.The structures of isolated compoundswere identified by spectral analysis and TLC.Then their anti-platelet aggregation activities were screened.RESULTS Nine compounds were isolated from this plant and identified as leonurine（1），syringaresinol（2），medioresinol（3），linarin（4），apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside（5），syringic acid ethyl ester（6），ethyl 4-hydroxybenzoate（7），p-hydroxybenzyl ethyl ether（8），β-daucosterol（9）.CONCLUSION Compounds 2-4，6 and 8 are obtained from L.sibiricus for the first time.Among them，compounds3 and 6 are firstly isolated from genus Leonurus.In addition，compounds 1，4 and 5 can significantly inhibit platelet aggregation induced by ADP.

Leonurus sibiricus；chemical constituents；anti-platelet aggregation；adenosine diphosphate（ADP）；isolation and identification

R284.1

A

1001-1528（2015）11-2439-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.022

2015-07-24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81303209）；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （2014M562291）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2012JYZ005）；四川省科技支撐計(jì)劃 （2011SZ0056）

劉 娟（1989—），女，碩士，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：liuj755088@163.com

*通信作者：熊 亮 （1983—），男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)研究。Tel：（028）61800231，E-mail：xiling0505@126.com