杜 曄， 陳洪英

（1.西峽縣中醫(yī)院，河南西峽474550；2.河南省宛西制藥股份有限公司，河南南陽(yáng)474500）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定柴歸消癥膠囊中6種成分

杜 曄1， 陳洪英2*

（1.西峽縣中醫(yī)院，河南西峽474550；2.河南省宛西制藥股份有限公司，河南南陽(yáng)474500）

目的 建立同時(shí)測(cè)定柴歸消癥膠囊中芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸6種成分的的分析方法。方法 采用Phenomenex Luna 5u C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm（0～25 min），322 nm（25～30.2 min），237 nm（30.2～40 min），284 nm（40～48 min），329 nm（48～65 min），237 nm（65～85 min）。結(jié)果 芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的進(jìn)樣量分別在0.396 8～3.968μg（r=0.999 3）、0.025 2～0.252μg（r= 0.999 6）、0.111 2～1.112μg（r=0.999 4）、0.566～5.66μg（r=0.999 7）、0.018 6～0.186μg（r=0.999 5）、0.174～1.74μg（r=0.999 2）范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為97.1%、96.6%、97.6%、97.0%、96.5%、97.0%，RSD分別為0.95%、0.87%、0.88%、0.90%、1.0%、1.2%。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可有效地控制柴歸消癥膠囊的質(zhì)量。

柴歸消癥膠囊；芍藥苷；阿魏酸；甘草苷；橙皮苷；迷迭香酸；甘草酸；RP-HPLC

柴歸消癥膠囊為西峽縣中醫(yī)院名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，由柴胡、當(dāng)歸、青皮、夏枯草、白芍、甘草等10味中藥制成，具有疏肝理氣、消腫止痛的功效，臨床上用于治療肝郁氣滯氣血失調(diào)引起的乳腺小葉

增生、乳房脹痛、月經(jīng)不調(diào)及面部黃褐斑等癥，療效確切。根據(jù)方中所含成分的理化性質(zhì)，以當(dāng)歸、青皮、夏枯草、白芍、甘草的主要成分阿魏酸、橙皮苷、迷迭香酸、芍藥苷、甘草苷、甘草酸為指標(biāo)性成分，采用RP-HPLC對(duì)6種成分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，為柴歸消癥膠囊質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀及其化學(xué)工作站，包括四元梯度泵，DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器；METTLER TOLEDO MS105、AL104型電子天平；KQ-500VDE型超聲波清洗器；UP超純水機(jī)。

1.2 試劑 所用甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 對(duì)照品 芍藥苷 （批號(hào)110736-201035）、阿魏酸 （批號(hào) 0773-9809）、甘草苷 （批號(hào) 111610-201005）、橙皮苷 （批號(hào)110721-200613）、迷迭香酸 （批號(hào) 111871-201203）、甘草酸銨 （批號(hào)110731-201116），所有對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 樣品 柴歸消癥膠囊由西峽縣中醫(yī)院自制（批號(hào)分別為140501、140601、140701）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-13］，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定色譜條件。Phenomenex Luna 5u C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相C相為乙腈，D相為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～18 min，12%～15%C；18～35 min，15%～18%C；35～40 min，18%～20%C；40～44 min，20%～22%C；44～56 min，22%C；56～70 min，22%～36%C；70～85 min，36%～48%C）；檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm（0～25 min），322 nm（25～30.2 min），237 nm（30.2～40 min），284 nm（40～48 min），329 nm（48～65 min），237 nm（65～85 min）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2 000。在此條件下，6種成分與其他組分能達(dá)到較好分離。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 分別取經(jīng)P2O5干燥的6種對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加70%甲醇制成每1 mL含芍藥苷198.4μg、阿魏酸12.6μg、甘草苷55.6μg、橙皮苷283.0μg、迷迭香酸9.3μg、甘草酸銨87.0μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的柴歸消癥膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，用20 mL移液管加入70%甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲 （400 W、80 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方及制法分別制備不含白芍、當(dāng)歸、甘草、青皮、夏枯草的陰性樣品，再按 “2.2.2”項(xiàng)下制備成白芍陰性對(duì)照溶液、當(dāng)歸陰性對(duì)照溶液、甘草陰性對(duì)照溶液、青皮陰性對(duì)照溶液、夏枯草陰性對(duì)照溶液。另按處方及制法制備同時(shí)不含白芍、當(dāng)歸、甘草、青皮、夏枯草的全陰性樣品，再按 “2.2.2”項(xiàng)下制備成全陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別吸取上述3種溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按擬定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)6種成分與其他組分色譜峰均可基線(xiàn)分離 （R＞1.5），且陰性無(wú)干擾。對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2、4、8、10、12、16、20μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X，μg），相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行計(jì)算，各對(duì)照品質(zhì)量與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 6種成分的線(xiàn)性關(guān)系Tab.1 Linear reIationships of six com ponents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按擬定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，6種成分芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的峰面積的RSD值分別為0.59%、 1.38%、 0.89%、 0.70%、 1.2%、0.19%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品 （批號(hào)140501），按 “2.2.2”項(xiàng)下方法分別平行制備6份供試品溶液，依據(jù)擬定色譜條件進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的RSD值分別為0.88%、1.2%、1.1%、0.99%、1.5%和0.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 柴歸消癥膠囊中芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of paeonifIorin，feru Iic acid，Iiquiritin，hesperidin，rosmarinic acid and gIycyrrhizic acid in Chaigui Xiaozheng Capsu Ies

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h，按擬定色譜條件進(jìn)行測(cè)定、計(jì)算。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的 RSD值分別為1.2%、1.9%、1.5%、1.3%、1.7%和1.1%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知各成分含有量（含芍藥苷3.580 0 mg/g、阿魏酸0.270 3 mg/g、甘草苷1.010 8 mg/g、橙皮苷5.541 3 mg/g、迷迭香酸0.209 4 mg/g、甘草酸1.355 7 mg/g）的樣品（批號(hào)140501）約0.5 g，共6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入 “2.2.1”項(xiàng)下配制的混合對(duì)照品溶液10 m L，再精密加入70%甲醇10 mL，依據(jù) “2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬定的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸的平均回收率均大于95.0%。表明方法回收率良好。

2.9 樣品測(cè)定 取 3批樣品 （批號(hào)140501、140601、140701）裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，每批3份，每份約1 g，分別制備供試品溶液，按擬定色譜條件對(duì)3批樣品 （進(jìn)樣量10μL）進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算，數(shù)據(jù)以x±s表示，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Resu Its of recovery tests（n=6）

3 討論

3.1 測(cè)定成分的選擇 柴歸消癥方中當(dāng)歸具有補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、活血止痛、潤(rùn)腸通便的功效，為活血行瘀之要藥［14］，其中水溶性成分阿魏酸是其活性成分［15］；青皮具有疏肝破氣，消積化滯的功效，尤宜于治療肝郁氣滯之胸脅脹痛，疝氣疼痛，乳房脹痛［14］，其中黃酮苷類(lèi)橙皮苷為其主要成分［15］；夏枯草具有清肝瀉火，明目，散結(jié)消腫的功效，可治乳癰腫痛［14］。其中迷迭香酸是夏枯草的主要活性成分之一［16］；白芍具養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛，平抑肝陽(yáng)的功效，治療血虛肝郁，脅肋疼痛月經(jīng)不調(diào)［14］，其中芍藥苷為其主要成分［17］。甘草具補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的功效［14］，其中三萜類(lèi)化合物甘草酸及黃酮類(lèi)化合物甘草苷為其主要成分［15］。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，目前研究中同時(shí)定量測(cè)定芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸、甘草苷6種成分未見(jiàn)報(bào)道［2-13］。由于中藥復(fù)方制劑多由多味藥組成，其藥效是通過(guò)多種活性物質(zhì)同時(shí)發(fā)揮作用而實(shí)現(xiàn)的，單味藥或單種成分的檢測(cè)，難以控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量。故最終選擇以當(dāng)歸、青皮、夏枯草、白芍、甘草的主要成分阿魏酸、橙皮苷、迷迭香酸、芍藥苷、甘草苷、甘草酸6種成分為指標(biāo)性成分，進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 色譜柱考察 本制劑中成分復(fù)雜，且待測(cè)物質(zhì)較多，需要對(duì)所有待測(cè)物質(zhì)及干擾峰進(jìn)行分離?？疾炝薑romasil100R5C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、WelchxtimateTMX-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，對(duì)6個(gè)待測(cè)成分分離結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)芍藥苷、橙皮苷、阿魏酸很容易在各種色譜柱上與干擾峰分離，但甘草苷、迷迭香酸、甘草酸與其周?chē)母蓴_峰較難分離，最后采用Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250mm，5μm）色譜柱，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例及梯度洗脫時(shí)間，使各待測(cè)成分與周?chē)纳V峰基線(xiàn)分離，且峰型較好。

3.3 供試品溶液的制備［1-5］實(shí)驗(yàn)中比較了超聲提取和回流提取兩種方法制備供試品溶液，結(jié)果測(cè)得各成分含有量無(wú)明顯差異，因超聲法具有提取效率高、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，故選用超聲提取法；提取溶劑考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇，70%乙醇、結(jié)果70%甲醇提取效率較高，樣品成分提取完全；超聲時(shí)間考察了 10、20、30、40 min，發(fā)現(xiàn)各成分含有量，隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，但超聲30 min以后無(wú)明顯增加，故最終確定以70%甲醇為提取溶劑，提取時(shí)間為超聲提取30 min。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸、甘草苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為230、316、284、330、237、237 nm［1］。本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器在190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，芍藥苷在230、237 nm處有最大吸收；阿魏酸在322 nm處有最大吸收；橙皮苷在230、284 nm處有最大吸收；迷迭香酸在329 nm處有最大吸收；甘草酸在237、250 nm處有最大吸收；甘草苷在237 nm處有最大吸收。綜合考慮，既符合檢測(cè)需要，又簡(jiǎn)化試驗(yàn)方案，選擇237 nm，檢測(cè)芍藥苷、甘草酸、甘草苷；選擇322 nm，檢測(cè)阿魏酸；選擇284 nm，檢測(cè)橙皮苷；選擇329 nm，檢測(cè)迷迭香酸。采用程序波長(zhǎng)法，在不同時(shí)間段進(jìn)行波長(zhǎng)切換檢測(cè)，滿(mǎn)足各個(gè)測(cè)定成分在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定，可減少誤差。（20）：79-81.

表3 柴歸消癥膠囊中有效成分的測(cè)定Tab.3 Determ ination of effective com ponents in Chaigui Xiaozheng Capsu Ies

表3 柴歸消癥膠囊中有效成分的測(cè)定Tab.3 Determ ination of effective com ponents in Chaigui Xiaozheng Capsu Ies

批號(hào) 芍藥苷/（mg.g-1） 阿魏酸/（mg.g-1） 甘草苷/（mg.g-1） 橙皮苷/（mg.g-1） 迷迭香酸/（mg.g-1）甘草酸/（mg.g-1）140501 3.580 0±0.012 4 0.270 3±0.005 5 1.010 8±0.022 1 5.541 3±0.055 6 0.209 4±0.007 6 1.355 7±0.048 4 140601 3.535 6±0.060 9 0.270 8±0.005 6 1.008 4±0.026 0 5.494 9±0.058 6 0.205 6±0.007 7 1.321 6±0.018 5 140701 3.510 0±0.054 8 0.276 3±0.008 6 1.006 3±0.031 7 5.433 3±0.061 9 0.203 3±0.012 4 1.308 5±0.014 3

3.5 流動(dòng)相的選擇 文獻(xiàn)中多采用乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-水等流動(dòng)相［2-13］。本實(shí)驗(yàn)中采用梯度洗脫，曾用甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等作為流動(dòng)相，并調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，分離效果好，峰形好，基線(xiàn)較平穩(wěn)。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定該制劑中芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、甘草酸6種成分的含量，方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，為制定柴歸消癥膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：124-125，183，263，97，80-81.

［2］ 周 蓬，宋 青，馬 帥.HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒豉清顆粒中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素［J］.中成藥，2013，35（8）：1693-1696.

［3］ 樊 暉，田 原.HPLC同時(shí)測(cè)定軟堅(jiān)消癭顆粒芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20

［4］ 閻高穎，董娟妮，楊 洋，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定心腦康中6種成分［J］.中成藥，2013，35（8）：1672-1675.

［5］ 李 松，王 蓓，浦香蘭，等.HPLC-DAD法測(cè)定銀屑優(yōu)化顆粒中芍藥苷、甘草苷、落新婦苷、迷迭香酸和甘草酸［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2014，29（4）：373-376.

［6］ 柏 冬，范文武，牛曉紅，等.多波長(zhǎng)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桂枝湯中5種有效成分的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（1）：1-5.

［7］ 馮麗敏，趙瑞枝，盧傳堅(jiān).HPLC同時(shí)測(cè)定芍苓消銀片中芍藥苷、落新婦苷、綠原酸、迷迭香酸和甘草酸的含量［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31（9）：1097-1101.

［8］ 唐登峰，祝 明，陳 勇，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定冠心寧注射液中丹參素、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（1）：144-147.

［9］ 周 軍，孫 艷，張 晶，等.HPLC法測(cè)定十全大補(bǔ)糖漿芍藥苷、阿魏酸、肉桂酸及甘草酸的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29（9）：1501-1503.

［10］ 侯劍偉，丁 越，張 彤，等.HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定調(diào)更湯中 3個(gè)活性成分［J］.中成藥，2014，36（7）：1454-1457.

［11］ 李 娟，趙 迪，周悌強(qiáng)，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)肺益腎顆粒中淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷［J］.中成藥，2012，34（12）：2335-2339.

［12］ 孔 銘，朱玲英，王佩娟，等.HPLC測(cè)定補(bǔ)腎活血顆粒中芍藥苷、阿魏酸、淫羊藿苷的含量［J］.中成藥，2010，32（4）：600-603.

［13］ 師永清，唐淑荷，王愛(ài)軍.HPLC法同時(shí)測(cè)定導(dǎo)赤丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩甘和鹽酸小檗堿［J］.中成藥，2013，35（7）：1462-1465.

［14］ 高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.2版.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007：461，251，92，463，432.

［15］ 吳清和.中藥藥理學(xué)［M］.2版.北京：高等教育出版社，2007：223，136，221.

［16］ 付曉瑞，李繼昌，張明智.夏枯草近代研究概述［J］.中醫(yī)研究，2005，18（6）：60.

［17］ 康廷國(guó).中藥鑒定學(xué)［M］.2版.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007：91.

Sim u Itaneous determ ination of six constituents in Chaigui Xiaozheng Capsu Ies by RP-HPLC

DU Ye1， CHEN Hong-ying2*

（1.Xixia Hospital of Traditional Ghinese，Xixia 474550，Ghina；2.Henan Wanxi Pharmaceutical Go.，Ltd.，Nanyang 474500，Ghina）

AIM To establish a method for simultaneously determining six constituents in Chaigui Xiaozheng Capsules，including paeoniflorin，ferulic acid，liquiritin，hesperidin，rosmarinic acid and glycyrrhizic acid. METHODS The analysiswas carried outon Phenomenex Luna 5u C18（2）column（250 mm×4.6 mm，5μm）. Themobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min，the column temperature was30℃and the detection wavelengths were 237 nm，322 nm，284 nm and 329 nm，respectively.RESULTS The experiments showed good linearities in the ranges of 0.396 8-3.968 μg（r=0.999 3）for paeoniflorin，0.025 2-0.252μg（r=0.999 6）for ferulic acid，0.111 2-1.112μg（r=0.999 4）for liquiritin，0.566-5.66μg（r=0.999 7）for hesperidin，0.018 6-0.186μg（r=0.999 5）for rosmarinic acid，0.174-1.74μg（r=0.999 2）for Glycyrrhizic acid，respectively.The average recoveries were 97.1%，96.6%，97.6%，97.0%，96.5%，97.0%，respectively.The RSDs were 0.95%，0.87%，0.88%，0.90%，1.0%，1.2%，respectively.CONCLUSION Thismethod is simple，accurate and reproducible，and could be used for the quality control of Chaigui Xiaozheng Capsules.

Chaigui Xiaozheng Capsules；paeoniflorin；ferulic acid；liquiritin；hesperidin；rosmarinic acid；glycyrrhizic acid；RP-HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）11-2434-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.021

2015-01-09

杜 曄 （1969—），女，主管中藥師，從事藥物制劑及質(zhì)量研究。Tel：13623779389，E-mail：1457081325@qq.com

*通信作者：陳洪英 （1969—），女，副主任藥師，從事新藥開(kāi)發(fā)研究。Tel：13598270088，E-mail：chenhu0516@163.com