李艷萍， 曾煦欣， 謝燕婷， 譚 珍， 莫金玉， 吳劍峰*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東佛山528000；2.佛山馮了性藥業(yè)有限公司，廣東佛山528000）

HPLC法檢測(cè)60Co輻照對(duì)烏金丸有效成分的影響

李艷萍1， 曾煦欣1， 謝燕婷1， 譚 珍2， 莫金玉1， 吳劍峰1*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東佛山528000；2.佛山馮了性藥業(yè)有限公司，廣東佛山528000）

目的 考察不同劑量60Co輻照 （0、2、6和10 KGy）對(duì)烏金丸 （當(dāng)歸，益母草，香附，白芍，川芎等）有效成分的影響。方法 采用HPLC法檢測(cè)烏金丸中阿魏酸和芍藥苷輻照前后的含有量變化，所得結(jié)果利用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 阿魏酸在0、2、6和10 KGy的輻照劑量下，含有量分別為0.92、0.90、0.90和0.89mg/g；芍藥苷分別為1.76、1.83、1.78和1.78 mg/g。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，阿魏酸與芍藥苷的含有量與輻照前相比，無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）。結(jié)論60Co輻照滅菌對(duì)烏金丸有效成分的含有量無(wú)影響。

烏金丸；阿魏酸；芍藥苷；60Co輻照滅菌；HPLC

藥品安全是重大民生和公共安全問(wèn)題，中成藥原料復(fù)雜，制備工藝繁瑣，對(duì)于維持其質(zhì)量、安全性及藥效的穩(wěn)定方面是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)，在其生產(chǎn)環(huán)節(jié)中以滅菌問(wèn)題最為突出。輻照技術(shù)作為一項(xiàng)新興的綠色加工技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品的防腐保鮮、化學(xué)、生物方面等［1-2］，與傳統(tǒng)的食品保藏方法、加熱、冷藏、化學(xué)處理等相比，具有殺蟲滅菌徹底，不破壞食品結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)成分，不破壞原有包裝，無(wú)污染等顯著特點(diǎn)符合中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)規(guī)律，是近年來(lái)中藥材原料與中成藥滅菌的常用方法。早在1992年，就有文獻(xiàn)報(bào)道，在100萬(wàn)倫以下劑量照射，對(duì)中成藥、中藥材的色、香、味與未照射的比較，無(wú)顯著的差異［3］。但60Coγ輻照滅菌會(huì)引起個(gè)別中藥的化學(xué)成分、生物活性變化［4］，如白芍、天麻、紅花等均有成分發(fā)生改變的報(bào)道?！吨袊?guó)藥典》2010年版規(guī)定，只有不受輻射破壞的原料藥

及成品等才可用本法滅菌，60Coγ輻照滅菌應(yīng)事前驗(yàn)證所使用的劑量不影響被滅菌物品的安全性、有效性及穩(wěn)定性［5］。

烏金丸屬于經(jīng)典廣東佛山地區(qū)傳統(tǒng)中成藥（當(dāng)歸20 g，益母草320 g，香附120 g，白芍60 g，川芎60 g，延胡索60 g，補(bǔ)骨脂20 g，吳茱萸20 g，小茴香20 g，艾葉20 g，莪術(shù)20 g，蒲黃20 g，木香20 g，三棱20 g，熟地黃20 g，百草霜14 g，將以上16味中藥粉碎成細(xì)粉，混勻，過(guò)篩，每100 g粉末加煉蜜170～190 g制得），主治氣滯血瘀所致之胸脅刺痛或產(chǎn)后小腹瘀痛拒按，或痛經(jīng)等癥。近年，烏金丸通過(guò)60Coγ射線輻照的滅菌方法使其微生物限量得以有效控制，但對(duì)于輻照滅菌是否造成有效成分輻解以及生物活性、安全性改變，至今尚未有定論，同時(shí)也缺乏相應(yīng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC法考察60Co輻照對(duì)烏金丸有效成分阿魏酸和芍藥苷的影響，為其進(jìn)行輻照滅菌提供一定的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent-1260高效液相色譜儀；Agilent-1260MWD檢測(cè)器；Agilent TC-C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；法國(guó)賽多利斯BS-110S電子分析天平；AS5150B超聲波清洗器；ZTLH00005純水系統(tǒng)；移液槍。阿魏酸 （批號(hào)0773-9910，中國(guó)藥品生物制品檢定所），芍藥苷對(duì)照品 （批號(hào)110736-201337，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。烏金丸藥材為佛山馮了性藥業(yè)有限公司提供。乙腈和甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品置棕色量瓶中，用50%甲醇溶解，質(zhì)量濃度為65μg/mL，低溫保存。精密稱取芍藥苷對(duì)照品置棕色量瓶中，用50%甲醇溶解，質(zhì)量濃度為320μg/mL，低溫保存。

2.2 供試品制備 供試品的輻照工作由佛山馮了性藥業(yè)有限公司完成。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為，10 KGy及以下劑量對(duì)食品的輻照無(wú)需作毒理試驗(yàn)，因此高劑量選擇10 KGy。本實(shí)驗(yàn)選擇2、6、10 KGy共3個(gè)輻照劑量。烏金丸粉末 （過(guò)三號(hào)篩）分別在上述劑量下進(jìn)行輻照，不經(jīng)輻照處理的粉末作為空白 （0 KGy），即得所有供試品粉末樣品。

取供試品粉末4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，遮光密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻后濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；阿魏酸流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸 （15：85），檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm；芍藥苷流動(dòng)相為乙腈-水 （15：85），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；兩者體積流量均為1.0mL/min；進(jìn)樣量均為20μL；柱溫均為40℃。

2.4 專屬性試驗(yàn) 按 “2.3”項(xiàng)下色譜條件，將阿魏酸與芍藥苷對(duì)照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)供試品中成分與對(duì)照品阿魏酸與芍藥苷的出峰時(shí)間一致，供試品中兩者的分離效果均較理想。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按 “2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別對(duì)供試品和對(duì)照品溶液進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性考察，結(jié)果如表1所示。阿魏酸和芍藥苷的理論塔板數(shù)和分離度均達(dá)到定量檢測(cè)限要求。

表1 系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果Tab.1 Resu Its of system suitabiIity

2.6 線性關(guān)系考察 將阿魏酸和芍藥苷對(duì)照品溶液分別用50%甲醇稀釋，得到6個(gè)不同質(zhì)量濃度，按 “2.3”項(xiàng)色譜條件考察線性關(guān)系，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。阿魏酸線性方程為y= 90.042x+9.039 3，r2=0.999 5；芍藥苷線性方程為y=24.158x-0.208 6，r2=0.999 7。結(jié)果表明，阿魏酸在4.62～65μg/mL，芍藥苷在20～320 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 分別取阿魏酸和芍藥苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，阿魏酸和芍藥苷的峰面積平均值RSD分別為0.92%和1.3%，表明儀器的精密度良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密量取已知兩成分含有量的烏金丸供試品（0 KGy）溶液9份，每份4mL，分別精密加入芍藥苷 （500μg/mL）對(duì)照品溶液2 m L、1 mL和0.5 mL（即相當(dāng)于樣品中芍藥苷含量的200%、100%和50%），然后甲醇定量至10 mL。另外精密量取上述供試品 （0 KGy）溶液9份，每份5 mL，分別精密加入阿魏酸 （64 μg/mL）對(duì)照品溶液0.8 mL、0.4 mL和0.2 mL（即相當(dāng)于樣品中阿魏酸量的200%、100%和

50%），然后甲醇定量至10 mL。以上溶液按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣含有量測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果如表2所示。供試品阿魏酸和芍藥苷的平均回收率及RSD分別104.4%、2.5%、97.3%、2.9%。阿魏酸和芍藥苷的平均回收率均達(dá)到97%以上，并且RSD都小于3%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

圖1 對(duì)照品與供試品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s of reference substances and sam p Ies

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Resu Its of recovery tests

2.9 樣品測(cè)定 將 “2.2”項(xiàng)制備的0、2、6和10 KGy輻照劑量的供試品進(jìn)行色譜檢測(cè)，平行操作3次，采用 “2.6”項(xiàng)下的回歸方程分別計(jì)算供試品中阿魏酸和芍藥苷的含有量，結(jié)果如表3所示。

表3 樣品中阿魏酸和芍藥苷含有量Tab.3 Contents of feru Iic acid and paeonifIorin in sam p Ies

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 18.0軟件單因素分析（One-way ANOVA）對(duì)“2.9”項(xiàng)下測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以考察不同輻照劑量組之間的成分含有量差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表4。阿魏酸和芍藥苷的P值均大于0.05，表明組間均數(shù)的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即這兩種成分經(jīng)不同劑量60Co輻照后含有量變化沒(méi)有差異，輻照滅菌不影響它們的含有量。

表4 單因素分析結(jié)果Tab.4 Resu Its of One-way ANOVA

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇 《中國(guó)藥典》未記載烏金丸輻照滅菌的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。目前，應(yīng)用較廣泛的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法是對(duì)已知的幾個(gè)主要成分或有效成分作為指標(biāo)成分予以檢測(cè)控制［6］。從烏金丸的處方分析可知，當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血、止痛、潤(rùn)腸等功效，是烏金丸中的君藥，其主要有效成分阿魏酸具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、提高機(jī)體免疫力等作用［7］。處方中川芎的主要有效成分也是阿魏酸。因本品為大蜜丸，處方復(fù)雜，干擾嚴(yán)重，另一君藥益母草無(wú)法獲得較好的液相色譜圖［8］，故不選擇作為指標(biāo)成分檢測(cè)。而白芍作為本品的臣藥，其有效成分芍藥苷具有抗菌養(yǎng)血作用，在方中發(fā)揮重要作用。因此本實(shí)驗(yàn)選擇阿魏酸和芍藥苷作為指標(biāo)成分，參照相似中成藥 （十二烏雞白鳳丸）檢測(cè)方法文獻(xiàn)［9-10］，應(yīng)用HPLC法對(duì)其成分進(jìn)行定量測(cè)定，以考察60Co輻照對(duì)烏金丸有效成分的影響。

3.2 提取溶劑的選擇 供試品分別用50%甲醇和純甲醇提取作比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用50%甲醇作為溶劑時(shí)，芍藥苷的峰面積明顯比用純甲醇提取的大，而這兩種溶劑下阿魏酸的峰面積沒(méi)有差別。因此選擇用50%甲醇為供試品提取溶劑。

3.3 樣品的保存 阿魏酸不穩(wěn)定，見(jiàn)光、加熱均易分解［11］，所以在配制對(duì)照品和供試品溶液時(shí)采用棕色量瓶，超聲溶解時(shí)水浴溫度控制在30℃以下，相關(guān)操作在避光條件快速進(jìn)行［12］。芍藥苷是白色吸濕性無(wú)定形粉末，溶液長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，含有量會(huì)有所降低。因此，本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照品和供試品溶液均避光密封低溫保存。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC法考察不同劑量60Co輻照（0、2、6、10 KGy）對(duì)烏金丸有效成分阿魏酸和芍藥苷的影響。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出，以上不同60Co輻照量對(duì)烏金丸中阿魏酸及芍藥苷含有量均無(wú)影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究60Co輻照滅菌對(duì)烏金丸成分的影響提供一定的基礎(chǔ)，也為其生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程提供一定的參考依據(jù)。另外，對(duì)于烏金丸中其他成分的研究正在進(jìn)行中，希望通過(guò)更多的成分指標(biāo)考察60Co輻照對(duì)烏金丸質(zhì)量的影響。

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InfIuence of60Co irradiation on active components in W ujin PiIIs by HPLC

LIYan-ping1， ZENG Xu-xin1， XIE Yan-ting1， TAN Zhen2， MO Jin-yu1， WU Jian-feng1*

（1.Medical Gollege，F(xiàn)oshan University，F(xiàn)oshan 528000，Ghina；2.Fengliaoxing Pharmaceutical Gompany，F(xiàn)oshan 528000，Ghina）

AIM To investigate the effect of60Co irradiation（0，2，6 and 10 KGy）on active constituents in Wujin Pills（Angelicae sinensis Radix，LeonuriHerba，GyperiRhizoma，Paeoniae Radix alba，etc.）by high-performance liquid chromatography（HPLC）.METHODS HPLC was employed to determine the contents of ferulic acid and paeoniflorin under different60Co irradiation doses.The obtained results were further analyzed by SPSS 18.0.RESULTS Exposed to 0，2，6 and 10 KGy60Co，the detected ferulic acid contents were 0.92，0.90，0.90 and 0.89 mg/g，respectively，and the paeoniflorin contentswere 1.76，1.83，1.78 and 1.78 mg/g，respectively.Through SPSS analysis，no statistical significance ofmeasured constituents was found between the data before and after irradiation（P＞0.05）.CONCLUSION There is no influence on the contents of active constituents in Wujin Pills with60Co irradiation.

Wujin Pills；ferulic acid；paeoniflorin；60Co irradiation sterilization；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）11-2430-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.020

2015-02-06

佛山社會(huì)組織發(fā)展專項(xiàng)扶持基本項(xiàng)目 （20140430）；佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項(xiàng)目 （2014AB00260）；廣東省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目 （201411847043）

李艷萍（1985—），女，博士，講師。Tel：（0757）82836985，E-mail：lypfosu@126.com

*通信作者：吳劍峰 （1960—），女，博士，教授，從事天然活性成分的研究與開(kāi)發(fā)。Tel：13612540388，E-mail：jianfeng839@ sina.com