劉 靜， 趙劍鋒， 馬雙成， 戴 忠*

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京100050；2.北京市延慶縣食品藥品監(jiān)督管理局，北京102100）

HPLC法同時測定紅花注射液中3種活性成分

劉 靜1， 趙劍鋒2， 馬雙成1， 戴 忠1*

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京100050；2.北京市延慶縣食品藥品監(jiān)督管理局，北京102100）

目的 建立同時測定紅花注射液中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種活性成分的反相高效液相色譜法。方法 紅花注射液0.45μm微孔濾膜濾液分析采用Phenomenex Luna C18色譜柱（4.60mm×250mm，5μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，體積流量1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長265 nm。結果 紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷分別在0.101～2.02 μg（r=0.999 6），0.216～4.32μg（r=0.999 7），0.510～10.2μg（r=1）范圍內線性關系良好；平均加樣回收率分別為97.4%、102.3%、100.3%，RSD分別為2.1%、2.1%、1.5%。結論 本法準確、簡單、重復性好，能更好地控制紅花注射液的質量。

紅花注射液；紫丁香苷；羥基紅花黃色素A；（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷；HPLC

紅花注射液是由紅花Garthamus tinctorius L.藥材經水煮醇沉等工藝加工而成的中藥注射劑，具有活血化瘀功效，用于治療閉塞性腦血管疾病、冠心病和脈管炎，臨床療效顯著。文獻調研表明，紅花注射液的質量控制研究主要集中于羥基紅花黃色素A、腺苷及槲皮素等個別成分的定量測定以及特征圖譜研究等方面［1-10］。

為闡明紅花注射液的活性成分，課題組對紅花注射液化學成分進行了較為深入的研究，同時采用功效相關生物活性測定方法［11-12］，對其中分離得到的單體成分進行了體外抗血小板聚集活性測試，并報道除公認的羥基紅花黃色素A外，黃酮、多炔苷等成分亦具有較好活性［13］。綜合分析上述研究結果發(fā)現(xiàn)，紫丁香苷、羥基紅花黃色素A以及（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-葡萄糖苷在紅花注射液中不僅含有量高、而且活性較好。此外，鑒于紅花注射液現(xiàn)行質量標準含量測定項下僅對羥基紅花黃色素A單一活性成分進行測定的現(xiàn)狀［14］，本實驗旨在建立能夠同時測定紅花注射液中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與 （8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種活性成分的高效液相色譜法，以便為更好地控制紅花注射液質量提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀及工作站（美國Waters公司）；Mettler AE-240電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Millipore Synergy-UV超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥 紫丁香苷 （批號111574-200603）、羥基紅花黃色素A（批號111637-201207）對照品由中國食品藥品檢定研究院提供；（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷（自制，純度大于98%）。紅花注射液，批號分別為13051601、13082002、13082501、 13021502、 13082301、 13062801、13062701、13021701、13082801（規(guī)格均為 10 mL），12040701（企業(yè)小樣）均由A企業(yè)提供。乙腈為色譜純（美國Thermofischer公司）；磷酸為分析純 （中國北京化工廠）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相A為0.1%磷酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫 （0～20 min，10%～12%B；20～50 min，12%～35%B；50～60 min，10%B）；柱溫30℃；體積流量1.0mL/min；檢測波長265 nm；進樣量為10μL。在上述條件下，樣品中各對照品與其他組分基本達到基線分離。結果見圖1。

2.2 混合對照品溶液制備 取對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 m L含紫丁香苷、羥基紅花黃色素A、（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖

苷分別為0.101、0.216、0.510 mg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

圖1 對照品與紅花注射液樣品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and Honghua Injection sam p Ies

2.3 供試品溶液制備 取紅花注射液樣品，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學研究

2.4.1 測定波長的選擇 根據(jù)紫丁香苷、羥基紅花黃色素A以及（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種成分的UV光譜圖，設定265 nm，能夠同時檢測3種成分。

2.4.2 線性關系考察 精密吸取 “2.2”項下混合對照品溶液各1、2、5、10、20μL進樣，按“2.1”項下色譜條件測定。以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 回歸方程Tab.1 Regression equations

2.4.3 精密度試驗 精密吸取供試品溶液10μL，重復進樣6次，按 “2.1”項下色譜條件測定。按紫丁香苷、羥基紅花黃色素A、（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積計算RSD值分別為0.2%、0.1%和0.2%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批樣品6份，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算，結果樣品中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A和（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷的含有量分別為0.050 4、0.161、0.341 mg/mL，RSD分別為1.3%、2.9%、2.5%，表明方法重復性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h按 “2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。結果樣品中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A和（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷在12 h內峰面積的RSD分別為0.3%、0.4%和0.2%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密吸取已知成分含有量的紅花注射液樣品 （12040701）5 mL，平行6份，置10 m L量瓶，分別精密加入混合對照品溶液（含紫丁香苷0.050 8 mg/mL，羥基紅花黃色素A 0.161 mg/mL，［8Z］-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷0.338mg/mL）5mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，進樣20μL，其余色譜條件按 “2.1”項下進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Resu Its of recovery tests（n=6）

2.4.7 樣品測定 取不同批次的紅花注射液，按“2.3”項下制備供試品溶液，進樣10μL，按“2.1”項下色譜條件測定。以標準曲線計算樣品中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A及 （8Z）-癸烯-

4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種活性成分的量，結果見表3。

表3 樣品測定結果（mg/m L）Tab.3 Resu Its of determ ination of samp Ies（mg/m L）

3 討論

本實驗檢測波長的選擇依據(jù)紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3個化合物的紫外吸收光譜及其分離度等因素確定為265 nm。

流動相分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等系統(tǒng)，最終選擇分離度較好的乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。

本實驗建立的HPLC法同時測定了紅花注射液中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種不同結構類型活性成分的量，更好地體現(xiàn)了中藥制劑的多組分特性，為紅花注射液質量控制水平的進一步提高與完善提供了科學依據(jù)。

本實驗建立的質量控制方法對于紅花注射液的多指標控制提供了有益參考。今后通過多廠家多批次的紅花注射液產品測定和驗證，可以確定上述各成分指標的含有量限度，為進一步提升為紅花注射液的質量控制標準奠定基礎。

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［14］ WS3-B-3825-98-2012，紅花注射液藥品標準［S］.

Sim u Itaneous determ ination of three active constituents in Honghua Injection by HPLC

LIU Jing1， ZHAO Jian-feng2， MA Shuang-cheng1， DAIZhong1*

（1.National Institutes for Food and Drug Gontrol，Beijing 100050，Ghina；2.Yanqing Gounty Food and Drug Administration，Beijing 102100，Ghina）

AIM To establish a reversed-phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）method for simultaneously identifying the contents of three major active constituents（sirongoside，hydroxysafflor yellow A and［8Z］-decaene-4，6-diyne-1-O-β-D-glucopyranoside）in Honghua Injection.METHODS The analysis of Honghua Injection filtrate through microporousmembrane was performed on a Phenomenex Luna C18column with acetonitrile and 0.1%phosphoric acid solution asmobile phase in a gradient elutionmanner.The detection wavelength was set at265 nm.RESULTS The calibration curveswere linearwithin the ranges of 0.101-2.02μg for sirongoside（r=0.999 6），0.216-4.32μg for hydroxysafflor yellow A（r=0.999 7）and 0.510-10.2μg for（8Z）-decaene-4，6-diyne-1-O-β-D-glucopyranoside（r=1），respectively.Their average recoveries were 97.4%，102.3%and 100.3%，and RSDswere1.3%，2.1%and 1.5%，respectively.CONCLUSION This accurate，simple and repeatable method provides sound support for the quality control of Honghua Injection.

Honghua Injection（Garthamus tinctorius L.）；sirongoside；hydroxysafflor yellow A；（8Z）-decaene-4，6-diyne-1-O-β-D-glucopyranoside；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）11-2426-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.019

2015-01-19

中國食品藥品檢定研究院2012年中青年發(fā)展研究基金課題 （2012A7）

劉 靜，女，博士，副研究員，從事中藥化學、中藥分析研究。Tel：（010）67095376，E-mail：liujing_zsm@126.com

*通信作者：戴 忠，男，博士，研究員，碩士生導師，從事中藥質量控制及中藥化學對照品研究。Tel：（010）67095376，E-mail：daizhong@nifdc.org.cn