黃 宇， 王毓杰， 楊文娟， 張 藝， 賴先榮

（1.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，四川成都611137；2.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川成都611193）

［質 量］

HPLC法測定多血康膠囊中6個成分

黃 宇1，2， 王毓杰1*， 楊文娟1， 張 藝1， 賴先榮1

（1.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，四川成都611137；2.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川成都611193）

目的 建立HPLC法測定藏藥多血康膠囊 （大花紅景天、余甘子、沙棘、干姜）中紅景天苷、沒食子酸、柯里拉京、槲皮素、山柰素、異鼠李素等6種成分。方法 多血康膠囊70%甲醇提取液分析采用Wondasil C18-WR色譜柱 （4.6mm×250 mm，5μm），流動相Ⅰ為甲醇-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫，檢測波長275 nm，測定紅景天苷、沒食子酸和柯里拉京；流動相Ⅱ為甲醇-0.4%磷酸溶液 （48：52），檢測波長370 nm，測定槲皮素、山柰素、異鼠李素。體積流量為1 m L/m in，柱溫30℃，進樣10μL。結果 各成分均達到基線分離，在其線性范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，r≥0.999 7。加樣回收率值為99.1%～101.7%，RSD值為0.69%～1.7%。結論 本方法以多血康膠囊的入血成分為指標，建立了簡便、準確，專屬性和重復性好的定量測定方法。

多血康膠囊；紅景天苷；柯里拉京；異鼠李素；HPLC

高原紅細胞增多癥（high altitude polycythemia，HAPC）系由高原低氧引起紅細胞增多、血液黏稠的常見高原病，又名 “多血癥”。我國青藏高原人群患病率為2.5%［1］。隨著海拔升高，HAPC患病

率明顯增高，已成為嚴重威脅高原人群健康的常見慢性疾病之一。藏藥復方多血康是著名藏醫(yī)措如.才郎大師治療多血癥的經驗方，療效確切。該方以紅景天為君藥，活血清肺、滋補元氣；以余甘子清熱化瘀、沙棘活血散瘀為臣藥；以干姜舒胸、潤腔、生胃火為佐藥［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明其能緩解機體疲勞、提高缺氧耐受力［3］。在前期研究中，課題組選擇血瘀證模型與高原缺氧多血癥動物模型，從細胞及基因水平，闡明了多血康治療高原多血癥的分子機制；采用血清藥物化學及體外化學指紋圖譜方法，明確了藏藥多血康的入血成分主要來源于紅景天、余甘子、沙棘膏［3-5］。目前，對于該方還缺乏全面的質量控制研究。本實驗以紅景天、余甘子、沙棘中的主要入血成分為指標，建立多成分定量測定方法，為進一步提高多血康膠囊的質量控制水平提供參考依據(jù)。

1 材料

美國Aglient 1260高效液相色譜儀；Wondasil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5μm）；KQ-50B型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；BP121S電子天平（德國Sartorius公司）等。對照品沒食子酸、柯里拉京、紅景天苷、槲皮素、山柰素、異鼠李素均購自于中國食品藥品檢定研究院，批號分別 為 110831-201204、111623-200301、110818-201206、100081-201408、110861-201310、110860-201109。乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

多血康膠囊自制樣品5批 （批次DXK1～DXK5）。原藥材經成都中醫(yī)藥大學張藝研究員鑒定，為大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba的干燥根和根莖、余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實、中國沙棘H. rhamnoides L.subsp.sinensis Rousi.的干燥成熟果實、干姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，制備工藝參照專利方法［3］進行。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Wondasil C18-WR色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。流動相Ⅰ為甲醇 （A）-0.2%磷酸溶液 （B），梯度洗脫 （0～30 min，1%～14%A；30～65 min，14%～48%A）；檢測波長275 nm。流動相Ⅱ為甲醇（A）-0.4%磷酸溶液 （B）（48：52）；檢測波長370 nm；體積流量1 m L/min；柱溫30℃；進樣10μL。在上述色譜條件下，6個成分均能與相鄰色譜峰達到基線分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)不低于5 000。對照品、供試品、陰性樣品色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 混合對照品Ⅰ：精密稱取一定量的沒食子酸、紅景天苷和柯里拉京對照品，分別用甲醇溶解，制成質量濃度為0.996、0.634、0.835 mg/mL的對照品溶液。精密量取各對照品溶液，置同一量瓶中，加甲醇分別制成沒食子酸0.344 7 mg/m L、紅景天苷0.101 1 mg/mL、柯里拉京0.056 3 mg/mL的混合對照品?；旌蠈φ掌发颍壕芊Q取一定量的槲皮素、山柰素和異鼠李素對照品，分別用甲醇溶解，制成質量濃度為0.481、0.10、0.095 mg/mL的對照品溶液。精密量取各對照品溶液，置同一量瓶中，加甲醇分別制成槲皮素4.81μg/mL、山柰素20.00μg/m L、異鼠李素5.70μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 供試品溶液Ⅰ：取本品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 m L，密塞，稱定質量，超聲提取50 min，濾過，用少量甲醇分次洗滌容器及殘渣，洗液與濾液合并，揮干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置氧化鋁柱 （中性氧化鋁2 g，用水濕法裝柱，加15 mL水預洗）上，用70%甲醇洗脫，收集洗脫液，置25mL量瓶中，至洗脫液近刻度時為止，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。供試品溶液Ⅱ：取本品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，加入鹽酸3 mL，稱定質量，80℃水浴回流1 h，冷卻，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取上述2個混合對照品溶液6、8、10、12、15、20μL，按各色譜條件分別進樣，以峰面積為縱坐標，以對照品質量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關系數(shù)，見表1。

表1 多血康膠囊中6個成分的線性范圍Tab.1 Linear ranges of six com ponents in Duoxuekang Capsu Ies

圖1 多血康膠囊中6個成分的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of six com ponents in Duoxuekang Capsu Ies

2.5 精密度試驗 分別精密吸取混合對照品溶液Ⅰ、Ⅱ10μL，分別按流動相Ⅰ、Ⅱ色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄并分析色譜圖。各成分峰面積RSD值分別為1.0%、0.16%、1.5%、0.69%、0.94%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取供試品溶液Ⅰ、Ⅱ （DXK-3，下同）10μL，于0、2、4、6、10、24 h，分別按流動相Ⅰ、Ⅱ色譜條件進樣，記錄色譜峰面積。各成分的 RSD值分別為1.1%、0.15%、1.7%、0.75%、1.0%、1.1%，表明供試品溶液24 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一批樣品12份，分別按供試品溶液Ⅰ、Ⅱ制備方法制樣6份，分別進樣測定，各成分的RSD值分別為1.0%、0.13%、1.6%、0.58%、1.0%、1.0%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取成分含有量已知的供試品（DXK-3）18份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密吸取0.996 mg/mL沒食子酸對照品溶液6.5、8、10 mL，0.634 mg/mL紅景天苷對照品溶液3.6、4.5、5.4 mL，0.835 mg/m L柯里拉京對照品溶液1.6、2、2.4 mL各3份，低溫蒸干溶劑，按“2.3”項下供試品溶液Ⅰ制備方法制備；分別精密吸取混合對照品溶液0.8、1.0、1.2 mL（槲皮素0.135 mg/mL、山柰素0.630 mg/mL、異鼠李素0.149 mg/mL）各3份，低溫蒸干溶劑，按 “2.3”項下供試品溶液Ⅱ制備方法制備。然后按 “2.1”項下色譜條件Ⅰ、Ⅱ分別測定，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD，結果見表2、3。

2.9 樣品測定 取多血康膠囊樣品 5批，按“2.3”項下方法制備供試品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.1”項下色譜條件Ⅰ、Ⅱ分別測定，進樣10μL，測定結果見表4。

表2 沒食子酸、紅景天苷、柯里拉京加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Resu Its of recovery tests for gaIIic acid，saIidrosideand coriIagin（n=9）

表3 槲皮素、山柰素、異鼠李素加樣回收試驗結果 （n= 9）Tab.3 Resu Its of recovery tests for quercetin，kaem p feroIand isorhamnetin（n=9）

表4 樣品測定結果（n=2）Tab.4 Resu Its of the determ ination of samp Ies（n=2）

3 討論

藏藥復方多血康膠囊，是措如.才郎大師治療高原紅細胞增多癥（多血癥）的經驗方。課題組研究證實該方能夠降低紅細胞壓積和纖維蛋白原濃度，抑制紅細胞聚集［4］，降低血清EPO含有量［5］。并結合體外化學及體內血清指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)入血成分主要來源于紅景天、余甘子和沙棘膏［5］。因此，本研究選取了紅景天、沙棘、余甘子中的入血成分為指標，開展了其質量控制研究。

本實驗在對流動相Ⅰ篩選過程中，先后考察了乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液3種系統(tǒng)，結果表明，采用甲醇-0.2%磷酸作流動相時，色譜峰基線穩(wěn)定，分離度好［6-13］。提取方式和提取時間考察結果表明，選用70%甲醇溶液50 mL超聲提取50 min，目標成分提取效率較高。另外，本實驗測定槲皮素、山柰素、異鼠李素3個成分的方法與本實驗室建立的沙棘［12］、沙棘膏質量標準測定方法一致，該法已收錄至 《中國藥典》2015年版中，故本研究未進行論述。

本研究結合血清藥物化學的研究結果，以多血

康膠囊中的入血成分為指標，建立其定量測定方法，能夠為進一步提高多血康膠囊及其他藏藥復方的質量控制標準提供參考依據(jù)。

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Determ ination of six com ponents in Duoxuekang Capsu Ies by HPLC

HUANG Yu1，2， WANG Yu-jie1*， YANGWen-juan1， ZHANG Yi1， LAIXian-rong1

（1.Gollege of Ethnic Medicine，Ghengdu University of Traditional GhineseMedicine，Ghengdu 611137，Ghina；2.Neo-Green PharmeutiralGo.Ltd.，Ghengdu 611193，Ghina）

AIM To establish a high-performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneously identifying the contents of salidroside，gallic acid，corilagin，quercetin，kaempferol and isorhamnetin in Duoxuekang Capsules（Rhodiolae Grenulatae Radix et Rhizome，Phyllaxthi Fructus，Hippophae Fructus，Zingiber Rhizome）.METHODS 70%methanolic extractof Duoxuekang Capsules was performed on a Wondasil C18-WR column（4.6 mm×250 mm，5μm）.Themobile phaseⅠ（methanol and 0.2%phosphoric acid solution）was in a gradient elution for the determination of salidroside，gallic acid and corilagin with a detection wavelength setat275 nm.Themobile phaseⅡ（methanol and 0.4%phosphoric acid solution［48：52］）was for the determination of quercetin，kaempferol and isorhamnetin ata detection wavelength of370 nm.Their flow ratesweremaintained at1 m L/min at a column temperatures of30℃and a sample injection of 10μL.RESULTS Calibration curves of the six effective constituents revealed a good linear relationship（r≥0.999 7）.The average recovery was within the range of 99.1%-101.7%，and RSD value was 0.69%-1.7%.CONCLUSION Based on the detectable active constituents in the blood stream，a simple，specific and good repeatablemethod for the quantitative determination of Duoxuekang Capsules has been established.

Duoxuekang Capsules；salidroside；corilagin；isorhamnetin；high-performance liquid chromatography（HPLC）

R927.2

A

1001-1528（2015）11-2418-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.017

2015-02-27

江西中醫(yī)藥大學2011協(xié)同創(chuàng)新開放基金項目 （2011）

黃 宇（1990—），女，碩士，從事藏藥藥效物質基礎研究。E-mail：xiaohuangdoudou12@163.com

*通信作者：王毓杰，男，博士，主要從事中藥、民族藥藥效物質基礎及作用機制研究。E-mail：superwangyj@126.com